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CD8+T淋巴细胞对内毒素血症小鼠心脏功能的影响

背景
败血症患者50%发生心力衰竭预后不良,最突出的临床表现是心室扩张,心肌收缩功能及射血分数降低,并伴有严重外周血管舒张,血容量反应性降低.内毒素是引起败血症临床症状的主要触发原因,大量研究表明,内毒素血症时炎症细胞浸润对心肌损伤发挥着重要作用;其中T淋巴细胞在此过程中发挥重要作用.新近发现,CD8+T淋巴细胞在多种免疫性及炎症性疾病如慢性阻塞性肺疾病、获得性免疫缺陷综合症、肿瘤等发生发展中发挥着的非常重要的作用.然而CD8+T淋巴细胞在内毒素血症损伤心肌中的早期浸润及其对心功能的影响尚未见报道.
研究目的:
采用小鼠内毒素腹腔注射复制内毒素血症诱导心功能不全模型,6小时后采用超声心动技术检测心功能,流式细胞技术检测心脏组织CD8+T淋巴细胞表达情况.利用CD8敲除小鼠,明确其对内毒素血症心功能不全炎症作用及心功能的影响,从而为内毒素血症心脏损伤中早期炎症发生及心功能不全提供实验依据.
研究方法:
第一部分
实验探讨小鼠内毒素血症模型血中及心脏炎症细胞如单核-巨噬细胞,T淋巴细胞表达情况以及促炎因子iNOS的表达情况,将10只野生型(WT)小鼠(C57/BL)随机分为两组(n=5):
(1)野生对照组
(2)野生内毒素血症组
第二部分
实验探讨CD8+T淋巴细胞对内毒素血症心肌及心功能损伤作用,将10只野生型(WT)小鼠(C57/BL)随机分为两组(n=5).将CD8敲除(CD8 KO)小鼠各10只分别随机分成2组(n=5).
(1)野生对照组
(2)野生内毒素血症组
(3)CD8敲除对照组
(4)CD8敲除内毒素血症组
1.小鼠内毒素血症模型制作:采用单次腹腔注射脂多糖10mg/kg建立小鼠内毒素血症模型,对照组采用同计量生理盐水注射.
2.心功能测定:采用小动物超声心动仪测定小鼠心脏功能.
3.单核-巨噬细胞、T淋巴细胞在内毒素血症模型小鼠血中及心脏中表达水平:采用流式细胞技术进行检测.
4.心脏促炎因子测定:用免疫组织化学染色方法检测iNOS表达.
5.心肌纤维损伤情况检测:采用HE染色观察心肌纤维断裂情况.
6.测量数据以均数±标准差(-x±S)表示.符合正态分布的计量资料两组间比较采用成组t检验,不符合正态分布的计量资料采用秩和检验.组内各观察点间比较采用单因素方差分析.P<0.05表示有显著性差异,P<0.01表示有极显著性差异.所有数据用SPSS13.0软件进行统计.
结果:
1.第一部分试验中野生型小鼠使用10只,其中野生对照组5,存活5只;野生内毒素血症组5只,存4只.第二部分中野生对照组5只,存活5只:野生内毒素血症5只,存活4只,CD8敲除小鼠10只,其中CD8敲除小鼠对照组5只,存活5只;CD8敲除内毒素血症5只,存活5只.
2.观察脂多糖腹腔注射后小鼠行为表现及心脏超声检测:其中野生对照组和CD8敲除对照组行为表现无异常,心功能处于正常范围内;野生内毒素血症组和CD8敲除内毒素血症组行为表现异常,心功能下降,表明内毒素血症心功能不全模型制作成功.
3.采用CD8敲除小鼠对CD8+T淋巴细胞进行进一步研究,结果显示与野生对照组相比,野生内毒素血症组射血分数及短轴缩短分数显著降低(均为P<0.05);与野生内毒素血症组相比,CD8基因敲除内毒素血症组射血分数及短轴缩短分数均显著升高(均为P<0.05).
4.野生小鼠血细胞流式细胞学检测显示:野生小鼠内毒素血症组与野生对照组相比,内毒素:血症组F4/80+细胞即巨噬细胞、T淋巴细胞表达明显减少.野生小鼠心脏组织mac-2免疫组织化学染色显示:与野生对照组比,野生内毒素血症组小鼠mac-2阳性细胞即巨噬细胞浸润明显增多.小鼠心脏组织流式细胞分析:野生内毒素血症组较野生对照组比,心肌组织巨噬细胞即F4/80+细胞浸润显著增多(均为P<0.05).
5.野生小鼠心脏组织iNOS免疫组织化学染色显示:与对照组比,内毒素血症组小鼠心脏组织iNOS表达明显升高.
6.敲除组与野生组进行形态学分析,HE染色结果显示野生对照组及CD8敲除对照组小鼠心肌纤维完整,排列整齐,纤维互联呈网状,细胞核清晰,核膜完整;野生内毒素血症组心肌纤维肿胀,纤维大量断裂,部分核消失;CD8敲除组心肌细胞损伤轻,心肌纤维肿胀不明显,纤维断裂少.
结论:
1.内毒素血症早期引起全身炎症反应并导致心脏损伤,血中及心脏组织.单核-巨噬细胞、T淋巴细胞浸润增加,组织损伤因子iNOS在心脏组织表达上调.
2.CD8缺失情况下,内毒素血症小鼠心脏功能受损减轻,心功能明显好转.
本实验表明,内毒素血症导致心肌纤维损伤、心功能不全,心脏组织CD8+T等炎症细胞浸润:而缺乏CD8+T细胞时则减轻内毒素血症导致的心功能损伤,提示CD8+T细胞在急性内毒素血症诱导的心功能不全早期发挥重要促进作用.

作者:
屈超
学位授予单位:
首都医科大学
专业名称:
内科学(心血管病)
授予学位:
硕士
学位年度:
2012年
导师姓名:
杜杰
关键词:
内毒素血症;脂多糖;心功能;CD8+T细胞;炎症反应
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