高浓度乙醇发酵酵母菌株的选育及甘薯发酵酵醪渣应用性研究

生物乙醇,作为重要的清洁能源和可再生能源,被认为是化石能源的最好替代物.高浓度乙醇发酵技术能够提高单位设备的生产率和利用率,提高发酵终点乙醇的浓度,节约能源,成为降低乙醇发酵成本的有效途径.然而,高浓度乙醇发酵时,发酵微生物会不可避免地遇到一系列环境压力胁迫及自身代谢产物的影响,如发酵初期高浓度的葡萄糖产生的高渗透压、发酵终点高浓度乙醇、营养缺乏、低pH及发酵副产物抑制等,这些压力胁迫可能同时或依次出现,对发酵微生物造成损害,导致微生物发酵性能下降,影响乙醇发酵产量.因此,增强发酵微生物的环境压力抗逆性是改善、提高乙醇发酵能力的先决条件.
但是微生物对发酵环境中各种压力耐受性的机理十分复杂,其多重压力耐受性状的获得往往涉及大量的基因及众多相关代谢途径,很难通过代谢工程等理性操作方法来提高发酵菌株的多重压力抗逆性及发酵性能.进化工程作为一种全基因组水平的菌株选育方法,通过模拟自然进化中的变异和筛选过程,可在人工选择的压力下实现微生物性状的提高,尤其适用于对生理特性缺乏了解的菌株以及对菌株复杂性状的改良.因此,本研究应用进化工程的策略来增强酿酒酵母高浓度乙醇发酵的环境压力抗逆性能和乙醇发酵能力.
酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是目前生物乙醇发酵工业上应用最广泛、效果最好的发酵微生物.为了提高酿酒酵母对环境压力胁迫的抗逆性和高浓度乙醇发酵性能,本研究应用本实验室保存的一株乙醇高产酵母菌株SaccharomycescerevisiaeY-1经10轮的液氮反复冻融处理和筛选,再结合30%葡萄糖及12%的乙醇营造的具有高渗透压和高乙醇浓度的压力平板筛选,随后经35%(w/v)葡萄糖高浓度发酵进一步筛选,最终获得一株发酵效率在83%的高效高浓度乙醇发酵酵母突变株YF10-5.
压力耐受性研究表明,经过一系列处理后获得的酵母突变株YF10-5较出发菌株Y-1表现出明显增强的高渗透压耐受性和乙醇耐受性,能够耐受50%(w/v)葡萄糖产生的高渗透压力和20%(v/v)的高浓度乙醇胁迫.25%、30%、35%及40%葡萄糖高浓度乙醇发酵结果显示,酵母突变株YF10-5的乙醇产量分别为12.12%、14.04%、14.58%和14.36%(w/v),明显优于出发菌株.特别是在35%及40%葡萄糖高浓度乙醇发酵中,与出发菌株Y-1相比较,YF10-5的乙醇产量分别提高了16%和10%.
在35%和40%葡萄糖高浓度发酵条件下,探讨了酵母胞内海藻糖和麦角固醇的代谢积累变化.酵母YF10-5中海藻糖的含量在对数生长期、稳定期及发酵末期均显著高于出发酵母菌株Y-1;酵母YF10-5中麦角固醇的含量在对数期、稳定期及发酵末期较出发菌株Y-1也有明显提高.高浓度乙醇发酵环境胁迫下,酵母YF10-5胞内海藻糖和麦角固醇含量的增加,说明液氮冻融处理结合压力筛选改变了酵母菌株Y-1海藻糖和麦角固醇的代谢,对酵母YF10-5的抗逆性增强有作用.
在35%的葡萄糖高浓度发酵条件胁迫下,进一步对酵母突变株YF10-5中海藻糖和麦角固醇合成关键基因及热休克蛋白相关基因(HSP12、HSP26、HSP30及HSP104)的表达进行了研究.在发酵菌株对数生长期和稳定期,突变株YF10-5中TPS1编码的海藻糖合成基因的表达量在转录水平大幅提高;麦角固醇合成相关基因ERG9在菌株对数生长期的表达也明显上调;热休克蛋白基因HSP26、HSP30及HSP104在突变株YF10-5对数生长期及稳定期的表达量均明显增加,且在菌株稳定期的表达差异量要高于在对数期的基因表达差异量;HSP12基因在菌株YF10-5对数生长期的表达上调,而在稳定期表达量下降.结果表明,酵母YF10-5中相关耐受性基因的诱导过表达可能对酵母抗逆性的提高发挥作用.
对35%葡萄糖高浓度发酵中,发酵菌株对数期和稳定期时的乙醇代谢关键酶基因ADH1、删、PFK1及PYK1的相对表达差异变化趋势研究,以进一步探讨酵母YF10-5乙醇发酵性能提高的原因.结果发现,ADH1、HXK1及PFK1这三种关键酶基因在YF10-5中的表达量均有不同程度的明显增加,且这几种基因的表达谱类似:基因在菌株稳定期的表达差异量要高于在对数期的基因表达差异量.YF10-5中ADH1、HXK1和PFK1等关键酶基因表达量的增加可能乙醇的生成有一定促进作用.
我国甘薯资源丰富,是世界上最大的甘薯生产国,每年的甘薯产量约1.3亿吨.由于甘薯淀粉含量一般在20-30%之间,且产量巨大,是相对理想的生物乙醇生产原料.以甘薯为原料的酵母高浓度(初始糖浓度27.2%)乙醇发酵发现,酵母突变株YF10-5的终乙醇浓度为13.43%(w/v),乙醇产量提高了5.25%;YF10-5的乙醇发酵强度达4.09g/L/h,发酵效率为93.95%,且发酵时间较出发菌株缩短了3h.结果表明,酵母突变株YF10-5的甘薯高浓度乙醇发酵性能明显优于出发菌株Y-1.
甘薯作为新型能源作物,在发酵生产乙醇的过程中会产生大量含有丰富膳食纤维的甘薯发酵醪渣废弃物.在通常情况下,副产物甘薯发酵醪渣被当作废弃物丢掉或作为饲料以简单利用,这样不仅浪费了大量膳食纤维资源,薯渣废弃物的堆积也会对环境造成污染.因此,从甘薯乙醇发酵醪渣中开发、制备具有高附加值的膳食纤维,合理有效利用薯渣资源,对提升甘薯乙醇发酵产业良性发展,提高企业经济效益有重要促进作用.
以甘薯乙醇发酵醪渣为原料,采用碱性蛋白酶水解法制备膳食纤维,并测定分析了膳食纤维的化学组成、单糖组成及功能特性,为从甘薯乙醇发酵醪渣中开发、制备高附加值的膳食纤维提供理论依据.甘薯乙醇发酵醪渣成分分析发现,总膳食纤维含量为30.52%,且淀粉、脂肪含量低,可以作为制备膳食纤维的理想原料.在膳食纤维的制备中,通过单因素试验和正交试验分析表明,在反应体系pH8.0、温度55℃时,最佳提取条件是:碱性蛋白酶添加量为0.4%,反应时间为3h,料液比为1∶8.在此优化工艺条件下,膳食纤维的得率为30.38%,蛋白去除率为80.92%.制备获得膳食纤维成分分析表明,总膳食纤维含量为58.74%,主要以不溶性膳食纤维为主,蛋白含量为11.62%,脂肪为2.18%,水分为6.18%,符合商品化膳食纤维的主要指标要求.
甘薯乙醇发酵醪渣制备膳食纤维化学组成分析表明,膳食纤维中纤维素、半纤维素、酸性洗涤木质素和果胶含量分别为35.95%、6.58%、6.16%和16.18%;甘薯发酵醪渣膳食纤维中单糖主要葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和甘露糖等组成,其含量分别为6.72%、4.94%、3.78%、4.13%和5.06%;甘薯发酵醪渣制备膳食纤维的溶胀力(SWC)、持水力(WRC)和持油力(ORC)分别为5.52mL/g干重、3.76g/g干重、1.39g/g干重.
最后,本文探讨了30%葡萄糖高浓度振荡或静止发酵过程中酿酒酵母α-葡萄糖苷酶的活性变化及引起发酵性能差异的原因,同时分析了高浓度葡萄糖发酵液中糖的组成变化.结果表明,在相同发酵时间内,振荡发酵中乙醇产量、残还原糖量、发酵强度及发酵效率均明显优于静止发酵.酿酒酵母不同部位α-葡萄糖苷酶活性检测表明,α-葡萄糖苷酶主要表现为胞内酶活性.酵母细胞内乙醇代谢途径关键酶活性分析发现,振荡发酵中(己)糖激酶、丙酮酸激酶及乙醇脱氢酶活性变化幅度更大,影响更为明显.发酵过程中的酵母细胞数量及活菌率测定表明,振荡发酵中酵母细胞数量远远多于静止发酵中酵母细胞数量,这可能是导致高浓度振荡发酵性能明显高于静止发酵的主要原因.30%葡萄糖高浓度发酵过程中,发酵液HPLC检测分析发现,发酵32h左右,发酵液中有寡糖的形成,质谱初步分析此寡糖为二糖.结合α-葡萄糖苷酶活性分析,α-葡萄糖苷酶可水解该二糖,说明α-葡萄糖苷酶活性活性的产生与寡糖的形成有一定关联.