稳定表达鸡B--LB基因的P815细胞株的建立及鉴定
Construction and Identification of P815Cell Line Stably Expressing Chicken B-LB
主要组织相容性复合体(Majorhistocompatibilitycomplex,MHC)是指某一染色体上的一组紧密连锁的基因位点组成的高度多态的基因群.MHC在脊椎动物体内普遍存在,其编码产物称为主要组织相容性抗原,与免疫功能密切相关,能够控制移植排斥反应、应答免疫以及调节免疫等.根据化学结构、组织分布及功能上的特点可将MHC分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三类.其中,MHCⅡ类分子是由α链和β链非共价键相连组成的一组高度多态的跨模型糖蛋白,在结构上MHCⅡ类分子分成肽结合区、Ig样区、跨膜区和胞浆区4个部位.鸡的MHC基因又称为B复合体,定位在16号微小染色体上.根据鸡的MHC基因编码蛋白类型的不同,我们把鸡的MHC分子分为B-F、B-L、B-G三类分子.其中B-L分子主要递呈外源性抗原,和哺乳动物的MHCⅡ分子具有同源性.编码B-L分子的基因包括编码α链的B-LA和编码β链的B-LB.本课题就是研究表达鸡MHCⅡ-β分子的B-LB.
相对于Ⅰ类分子分布的广泛性,Ⅱ类分子的分布比较局限,主要表达与B细胞、单核细胞,巨噬细胞和树突状细胞等专职抗原提呈细胞表面,还包括精子细胞以及某些活化的T细胞表面.MHCⅡ分子的主要功能是递呈外源性抗原片段,通过形成MHCⅡ-抗原肽复合物诱导和激活特异性的免疫应答反应.为了进一步研究鸡MHCⅡ类分子两条肽链在递呈抗原及免疫应答中的作用,尤其是较为多态性的鸡MHCⅡ-β链在鸡MHCⅡ中的作用,本课题采用分子生物学技术和细胞生物学技术,对MHCⅡ-β链基因(B-LB)进行了克隆和真核表达,并成功构建了能稳定表达鸡MHCⅡ-β链基因的细胞株.
首先,从GenBank中查获禽类MHCⅡ-β链基因序列,再根据载体pEGFP-N1的多克隆酶切位点和鸡MHCⅡ-β链基因序列分别设计两对引物.同时从鸡MHCⅡ-β链基因的332bp处到792bp处设计一对检测引物,用于检测细胞株的稳定性.从鸡脾淋巴细胞中抽提RNA,然后进行RT-PCR,最后利用特异性引物扩增出MHCⅡ-β链(792bp)的基因;利用特异性的限制性内切酶对PCR产物和载体进行双酶切,然后将这两个酶切后的片段连接得到重组载体pEGFP-N1/B-LB.使用脂质体转染法瞬时转染了COS7细胞(非洲绿猴肾成纤维细胞)和稳定转染了P815(小鼠肥大瘤细胞),经瞬时转染的cos7细胞,在荧光显微镜下,可以清楚的看到MHCⅡ-β链定位在内膜系统上.经稳定转染的p815细胞在利用G418筛选并传代10次后,利用特异性的检测引物经RT-PCR检测,成功得到了目的条带461bp.
结果表明本研究成功地克隆了鸡MHCⅡ-β链基因并成功构建了pEGFP-N1/B-LB真核表达重组质粒,获得了稳定表达绿色荧光蛋白GFP-鸡MHCⅡ-β融合蛋白的小鼠肥大细胞瘤P815细胞株,为针对MHCⅡ的抗肿瘤免疫学药物的药效评价建立了肿瘤细胞模型,同时为进一步研究鸡MHCⅡ的结构与功能奠定了基础.
- 作者：
- 廖翔
- 学位授予单位：
- 安徽农业大学
- 专业名称：
- 微生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2012年
- 导师姓名：
- 余为一
- 中图分类号：
- S831
- 关键词：
- 组织相容性复合体；鸡B--LB基因；稳定转染；P815细胞株；真核表达；基因克隆
- B-LB；stable transfection；P815cell line；COS7cell line