生物芯片在激酶活性和抑制剂筛选中的应用
激酶(kinase)催化蛋白质的磷酸化在生物的生命进程中起着重要的作用,激酶表达水平的失控通常与重大疾病的产生有关.激酶抑制剂是一类重要的药物候选化合物,因此,研究激酶与底物、抑制剂的相互作用具有重要意义.生物芯片是一种高通量分析技术,已被广泛应用于生命科学研究领域.它在研究多肽和激酶间的相互作用方面已经发展较为成熟,特别是与非放射性标记的检测方法相融合后,使其在激酶研究中表现出了巨大的应用价值.本文发展了一种以生物芯片为反应平台的非放射性分析方法,并将此方法应用于激酶与底物、抑制剂间相互作用的一系列研究中:
1.建立多肽芯片反应平台:从基片的选择、点样液的配比等方面对多肽芯片的制作条件进行优化,用荧光、共振光散射(RLS)和表面增强拉曼法对芯片进行检测.获得了适合激酶反应的多肽-激酶生物芯片.与传统激酶分析方法相比节时低耗,相对安全无放射性.
2.以蛋白激酶A(PKA),底物多肽(kemptide)和H89,HA1077,KN62三种抑制剂作为研究对象,利用所构建的多肽芯片法对激酶反应进行研究.这种分析方法对不同的PKA抑制剂具有高效选择性,有效地检测了H89对PKA的抑制作用,并获得了与文献报道相符的H89的半数抑制浓度(IC50).
3.用蛋白激酶A(PKA)与固定有不同结构的底物的多肽芯片反应,考察了五条不同序列的底物多肽对激酶活性和抑制剂效率的影响.实验结果表明PKA的磷酸化反应强度和抑制剂的抑制效率很大程度上都取决于底物多肽上磷酸化位点(RRXS)的数量的多少,并根据体系的检测信号强度获得了与激酶活性相关的Km值.
4.用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶A(PKA)和酪氨酸蛋白激酶(LCK)两种激酶对含有80种化合物的商业激酶抑制剂库进行了高通量的筛选,并定量计算了筛选出来的抑制剂的IC50值,实验结果与文献报道具有很好的一致性.
- 作者：
- 李桃
- 学位授予单位：
- 中国科学院研究生院
- 专业名称：
- 分析化学
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 2011年
- 导师姓名：
- 王振新
- 关键词：
- 生物芯片；激酶活性；抑制剂；筛选工艺
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