参与脑低氧预适应形成的cPKCγ相互作用蛋白鉴定及CRMP2在NMDA致神经元损伤中作用

脑卒中是威胁人类健康的第二大致死性疾病,具有高患病率、高复发率、高致残率、高死亡率的特点,而缺血性卒中占了脑卒中的60%~70%,目前的临床治疗效果还不尽人意.近年来,研究者们逐渐将研究重点转移到脑自身的内源性保护机制,即缺血/低氧预适应(Ischemic/Hypoxicpreconditioning,I/HPC).
我们课题组在以往的研究中利用小鼠整体HPC模型、海马脑片氧.糖剥夺(OGD)模型和离体细胞低氧模型发现,经典型PKCγ(cPKCγ)的激活可能参与了小鼠脑I/HPC的发生发展过程.然而,cPKCγ及其相互作用蛋白在I/HPC减轻小鼠缺血性脑损伤中的作用还不得而知.因此,本实验采用KEGG富集分析及功能性蛋白质组学分离鉴定了小鼠大脑皮层组织中cPKCγ相互作用蛋白,并分析重要的差异信号蛋白在缺血/低氧发生中的作用,以进一步明确cPKCγ的作用机制.
本实验分为在体实验和离体实验两部分.在体实验,选用成年雄性BALB/c小鼠(12-14w,18-22g)按以往报道方法制备整体HPC模型.利用免疫共沉淀、双向电泳和质谱等蛋白质组学技术分离并鉴定小鼠脑组织中cPKCγ/相互作用蛋白.离体实验中,利用蛋白印迹技术定量分析了NMDA对cPKCγ相互作用蛋白CRMP2表达、磷酸化水平的影响;利用MTT技术评估NMDA对过表达CRMP2蛋白的N2A细胞的损伤作用;通过MTT及Hoechst33342-PI染色评价TAT-CRMP2对N2A细胞的保护作用.实验数据使用单一因素方差分析(OnewayANOVA)和Bonferroni显著性检验进行统计学处理,并用均数±标准误(X±S.E.)表示,其中p<0.05为显著性差异.实验结果如下:
1.低氧预适应小鼠脑皮层组织cPKCγ相互作用差异蛋白鉴定
为揭示参与HPC脑保护作用的cPKCγ信号网络,我们应用蛋白质组学和免疫共沉淀技术对正常及HPC小鼠大脑皮层胞浆和膜相关蛋白组分中cPKCγ相互作用蛋白进行了分离和鉴定,正常小鼠脑皮层组织内,共鉴定到41个cPKCγ相互作用蛋白,其中胞浆成分18个,膜相关成分37个,两部分共有cPKCγ相互作用蛋白14个.利用凝胶分析软件对HPC前后的cPKCγ相互作用蛋白双向电泳图谱进行分析,胞浆成分中8个蛋白点在HPC后发生了明显变化(变化超过1.5倍),其中3个上调,5个下调;膜相关成分中15个蛋白在HPC后变化明显,其中14个显著上调,1个下调.根据鉴定结果,在胞浆成分中,HPC后CRMP2与cPKC7相互作用表达量增加,提示HPC使二者相互作用增强,cPKCγ-CRMP2可能参与了HPC的形成.
2.NMDA对原代培养海马神经元CRMP2蛋白表达及磷酸化水平影响
海马神经元培养10-14d,采用终浓度分别为100、200、300、400和500μM的NMDA(同时加入1/10浓度的甘氨酸)作用6h.利用蛋白印迹(Westernblot)及凝胶成像定量分析CRMP2蛋白表达、磷酸化水平及其水解程度.结果发现,CRMP2蛋白表达量分别为100%、98.9%±14.7%、91.9%±9.45%、100.6%±6.13%、113.8%±7.76%、104.6%±24.7%(n=5),NMDA作用后未见显著变化:与对照组相LL(100%),NMDA处理组CRMP2磷酸化水平显著降低(n=5),分别为51.6%±7.61%、47.4±14.1%、34.9%+14.6%、54.5±17.9%、53.5±17.7%:NMDA处理后,55KD水解产物(BDP)蛋白量相开始出现,但其相对量未随NMDA作用浓度增加而变化,各实验组BDP相对量分别为0、100%、135.80%±20.37%、134.56%±12.48%、129.31%±4.53%、101.48%±20.93%.在本实验条件下,NMDA对CRMP2去磷酸化及蛋白水解为非浓度依赖性.
我们继续观察NMDA作用不同持续时间对CRMP2蛋白表达、磷酸化水平及水解片段形成的影响.海马神经元培养10-14d,加入NMDA(300μM)/甘氨酸(30μM),我们设定以下时问点进行分析探讨,分别为10min或2、4、6、24h.利用Westernblot及凝胶成像定量分析CRMP2蛋白表达、磷酸化水平及其水解水平进行分析.结果发现,CRMP2蛋白表达量分别为:100%、80.8%±8.39%、111.8%+24.3%、94.4%±16.8%、88%±15.3%、58.2%±4.43%,NMDA作用后蛋白表达量未见显著变化.6h后,CRMP2磷酸化水平显著降低(n=5),CRMP2磷酸化水平分别为:100%、79.9%±7.68%、75.9%±6.45%、73.3%±11.4%、64%±8.93%、56.4%±14.2%.2h后,55KD处开始出现水解片段,各实验组蛋白水解量分别为:0、0、100%、95.01%±7.46%、110.30%±16.54%、35.52%±10.50%).在本实验条件下,NMDA对CRMP2去磷酸化及水解随持续时间延长未见增加.结果提示CRMP2去磷酸化及蛋白水解参与了NMDA的损伤.
3、过表达CRMP2蛋白对NMDA毒性刺激的影响
在前面的研究中,我们发现CRMP2参与了NMDA的损伤过程,然而其参与机制是促进或是拮抗NMDA毒性作用还未得到验证.我们采用CRMP2重组质粒(pDsRED2-N1-Dpys12-RFP)转染N2A细胞,转染72h后,在无血清培养基中加入300gMNMDA作用6h进行MTT实验.实验分为对照组、NMDA组、转染空质粒+NMDA组(空质粒组)及转染重组质粒+NMDA组(重组质粒组),细胞存活率分别为:100%、56.4%±1.23%、54.6%±0.6%、37.2%±1.49%.NMDA组、空质粒组、重组质粒组的细胞存活率均明显降低;重组质粒组细胞存活率低于NMDA组及空质粒组.CRMP2过表达可加重NMDA的毒性作用,提示CRMP2可能作为损伤蛋白参与NMDA的作用.
4、TAT-CRMP2对NMDA损伤作用的影响
我们设计了肽段TAT-CRMP2,可通过减少Calpain对内源性CRMP2的水解,减少BDP的形成.本实验分为对照组、NMDA处理组(NMDA组、)、生理盐水+NMDA组(生理盐水组)、低浓度TAT-CRMP2预处理+NMDA组(低浓度组)、高浓度TAT-CRMP2预处理+NMDA组(高浓度组).MTT实验后,各组细胞存活率分别为100%、57.3%±5.22%、59.0%±7.85%、83.5%±4.86%、87.1%±3.6%.NMDA组、生理盐水组的细胞存活率显著低于对照组(n=6),而高浓度组及低浓度组的细胞存活率均明显高于NMDA组和生理盐水组(n=6).结果显示,CRMP2水解片段的减少可以降低NMDA导致的细胞死亡.
我们采用HOECHST33342-PI双染色法,进一步观察了TAT-CRMP2预处理对NMDA损伤的保护作用,实验分为对照组、生理盐水+NMDA组(生理盐水组)、低浓度TAT-CRMP2+NMDA组(低浓度组)及高浓度TAT-CRMP2+NMDA组(高浓度组),各组细胞死亡率分别为:1、24.56±5.57、18.92±2.44、7.083±1.75.生理盐水组、低浓度组的细胞死亡率显著高于对照组(n=3),高浓度组的细胞死亡率显著低于生理盐水组、低浓度组,对照组与高浓度组之间未见显著性差异.适当浓度的TAT-CRMP2可以显著降低NMDA损伤,提示蛋白水解可能是CRMP2参与细胞损伤的主要途径.
综上所述,cPKCγ与胞浆蛋白CRMP2存在相互作用,此作用在HPC后加强,一定浓度NMDA作用6h后均可降低CRMP2的磷酸化水平,并且可在55KD处出现水解片段,NMDA作用早期未见水解片段形成;过表达CRMP2可促进NMDA对神经细胞的致死作用;采用TAT-CRMP2预处理细胞,可以明显降低NMDA的细胞毒性作用.本研究成果进一步丰富了人们对脑缺血/低氧损伤和适应相关信号转导机制的认识,并为临床寻找防治脑卒中等缺血/低氧性脑损伤药物提供了实验依据.