胡萝卜抗冻蛋白AFP基因的克隆及对葡萄的遗传转化
Cloning of Antifreeze Protein Gene from Carrot and Genetic Transformation of Grape
我国葡萄(Vitis vinifera)主栽品种抗冻性弱,根系的抗寒能力差,冬季需要埋土越冬;因此通过遗传转化将植物抗冻基因导入葡萄中,培育转基因葡萄新品系,对改良葡萄抗寒能力具有重要意义.本研究通过PCR方法成功克隆了胡萝卜抗冻蛋白AFP基因并对其进行序列分析,构建了胡萝卜AFP基因的植物表达载体pBI-AFP,以宝石无核(Ruby Seedless)为受体材料进行了遗传转化.主要结果如下:1以胡萝卜植物组织基因组DNA为模板,通过PCR方法,获得了胡萝卜抗冻蛋白AFP基因,并连接到pGEM-T easy载体中.2通过ProtParam软件和蛋白分析软件Predictprotein对AFP抗冻基因生物信息学的分析,预测该蛋白的分子式为C1709H2680N448O502S16,相对分子质量为38.048kDa,等电点为5.43,该蛋白为亲水性分泌型蛋白,有信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主.3pGEM-AFP和pBI-121经Sac I和Xba I双酶切后连接,转化到大肠杆菌E.coilDH5α感受态细胞,成功构建了植物表达载体pBI-AFP.4通过液氮冻融法将植物表达载体pBI-AFP导入根癌农杆菌EHA105菌株中,经抗生素抗性筛选和PCR鉴定重组质粒成功导入农杆菌,构建了工程菌pBI-AFP/At.EHA105.5获得了适宜宝石无核葡萄叶片诱导不定芽的适宜培养基: CH+2-iP4mg/L+6-BA2mg/L+TDZ4mg/L,不定芽的诱导率为53.3%;获得了适宜超级无核葡萄叶片不定芽分化的培养基:CH+2-iP1mg/L+6-BA1mg/L+TDZ0.5mg/L+CPPU0.5mg/L+ZT1mg/L,不定芽诱导率为46.7%.6采用根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化宝石无核葡萄,通过抗性筛选获得了转化葡萄植株,经PCR检测,初步证明目的基因AFP已导入葡萄植株中.
- 作者：
- 褚明宇
- 学位授予单位：
- 甘肃农业大学
- 专业名称：
- 果树学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2012年
- 导师姓名：
- 陈佰鸿
- 中图分类号：
- S663.1
- 关键词：
- 胡萝卜AFP；葡萄；再生；转化
- carrot AFP；grape；clone；regeneration；transformation