二斑叶螨对甲氰菊酯的抗性分子机理研究
Resistance Molecular Mechanism of Tetranychus Urticae (Koch) to Fenpropathrin

二斑叶螨Tetranychus urticae (Koch)是果树、蔬菜和农作物上危害最为严重的害螨种群,长期以来主要使用菊酯类等药剂防治.由于这些药剂毒力高,与环境相容性好,对天敌安全,成为甘肃果树害螨防治的支柱品种.但高剂量和高频次用药,带来了叶螨的抗药性.二斑叶螨对农药产生抗药性机制主要是由于靶标不敏感和解毒酶活性提高引起的,在分子水平上有3种情况可导致抗药性的产生:突变、基因扩增和过表达.本研究从分子水平上对二斑叶螨对甲氰菊酯产生抗性的靶标基因(钠离子通道)及不同解毒酶的基因进行克隆、序列分析及不同基因的表达模式分析,从基因水平揭示二斑叶螨对甲氰菊酯产生的抗药性分子机理,为螨类的抗性治理提供理论依据.本研究获得如下结果:1.利用RT-PCR,克隆获得二斑叶螨敏感和抗甲氰菊酯品系的钠离子通道基因(GenBank登录号为:JN881331和JN881332) cDNA全长5419bp,编码1805个氨基酸,包括结构域IS2-IVS5两条基因都含有选择性剪切SV1和SV2;通过敏感和抗性品系同源性比对发现二斑叶螨抗性品系中2个突变位点,分别是ⅢS6(F1538I)和ПS5-ⅢS1连接处(A1215D).并对二斑叶螨钠离子通道基因用邻接法进行系统发育树的构建,二斑叶螨与朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)同源性最高,为96.12%,与狄斯瓦螨(Varroa destructor)同源性为51.36%,与微小牛蜱(Boophilus microplus)同源性为33.83%.2.克隆获得二斑叶螨敏感品系酯酶基因cDNA全长基因1869bp,开放阅读框为1683bp,编码560个氨基酸(GenBank登录号为:JN034058).暂命名为TuCCEl,其中包括了由23个氨基酸组成的信号肽.该基因编码的氨基酸序列理论分子量为88.39kDa,等电点(pI)为5.7.二斑叶螨酯酶TuCCEl基因的氨基酸序列进行蛋白质(BLASTP)同源比对,发现克隆获得的酯酶基因氨基酸序列具有Ester ase-lipase和COesterase的保守结构域.二斑叶螨敏感品系酯酶TuCCEl基因氨基酸序列与朱砂叶螨T. cinnabarinus酯酶TCE2和桔全爪螨Panonychuscitri酯酶基因氨基酸序列的同源性最高,都为98%,与肩突硬蜱Ixodes scapularis酯酶1基因的同源性为60%,与其他动物酯酶的同源性类似于TuCCE1基因,在32%~36%之间.利用Scanprosite在线软件对其进行分析发现,克隆到的二斑叶螨酯酶基因都具有B型羧酸酯酶的F-[GR]-G-x(4)-[LIVM]-x-[LIV]-x-G-x-S-[STAG]-G (S是活性部位氨基酸残基)特征结构,TuCCEl基因所对应的B型羧酸酯酶保守结构序列分别为FGGNPDQVTIFGESAG,及保守的二硫键形成位点(EDCLFLNVIVT).从GenBank数据库中搜集到部分代表性的昆虫及蜱螨等酯酶系列的氨基酸序列进行系统发育树分析.结果表明,二斑叶螨酯酶基因与蜱螨目的朱砂叶螨和桔全爪螨同源性最高且属于一个类群.3.克隆获得二斑叶螨敏感品系P450基因cDNA全长基因1533bp的开放阅读框,编码510个氨基酸(GenBank登录号:JQ860112).起始密码子ATG,终止密码子TAA.该基因编码的氨基酸序列理论分子量为82.98kDa,等电点(pl)为7.28.其推导的氨基酸包含P450基因经典的血红素结合位点的共有序列FSGGKRICPG (446-455)、位于螺旋K中参与稳定核心结构的完全保守序列]ESLR (371-374).氨基酸序列相似性分析表明:与肩突硬蜱的同源性为33%.4.克隆获得二斑叶螨敏感品系2个GSTs的cDNA基因,全长分别为717bp和657bp,分别编码238和218个氨基酸的开放阅读框(GenBank登录号为:JQ86011和JQ860111),暂命名TuGSTol和TuGSTdl.进一步利用Protparam和Scanprosite等生物信息学软件分析了推导蛋白质的理化性质、保守基序等序列特征.TuGSTol和TuGSTdl理论分子量分别为38.77kDa和34.23kDa,等电点分别为5.89和5.14.获得二斑叶螨TuGSTol基因具有Omega家族GSTs的关键残基半胱氨酸C33(TuGSTol)催化位点,有保守N-端结构域,特征基序是ESLVIVNYL;获得二斑叶螨TuGSTdl基因具有Delta家族GSTs基因S11和N49(TuGSTd1)催化域的关键残基,P56-L142-G150-D157,是反映蛋白质折叠所形成的关键残基.TuGSTol和TuGSTdl通过GenBank数据库中与其他物种GSTs系列的氨基酸构建系统发育树分析,表明二斑叶螨TuGSTol基因与家蚕在一个分支上(30%)且属于Omega家族.二斑叶螨TuGSTdl基因与蜱螨目的桔全爪螨同源性最高(63%)且属于Delta家族.5.利用RT-PCR技术,从二斑叶螨体内获得了八条候选内参基因的扩增片段,并提交到GenBank,取得相应的登录号分别为ELF (JN881325):658bp;5.8SrRNA:371bp,; GAPDH (JN881330):335bp; RPL13a (JN881328):242bp; TBP (JN881326):365bp; SDHA (JN881329):343bp; α-TUB (JN881325):962bp; β-actin (JN881324):822bp.采用实时荧光定量PCR方法并使用geNorm和NormFinder两个软件共同筛选最适合二斑叶螨的内参基因.内参基因筛选结果为:a-Tublin、SDHA、RPL13a、GAPDH、ELF、5.8s rRNA和TBP表达稳定度的平均值M在不同品系中依次为0.381、0.537、0.609、0.625、0.639、和0.688,表达稳定度由低到高排序依次为a-Tublin<SDHA<RPL13a<GAPDH<ELF<5.8s rRNA<TBP;再通过NormFinder软件计算各内参基因的稳定度值α-tublin<GAPDH<RPL13a<SDHA<ELF<5.8S rRNA<β-actin<TBP,最终确定了不同品系二斑叶螨以a-Tublin基因作为理想的内参基因,根据SYBR Green I染料技术,进行二斑叶螨mRNA相对定量表达real-time PCR方法(qrtPCR).6.以α-tublin做为内参,解析了二斑叶螨不同品系的钠离子通道基因、酯酶基因、P450和GST基因在mRNA表达水平.结果表明,二斑叶螨抗甲氰菊酯品系中钠离子通道基因和酯酶基因的相对表达量分别为敏感品系的0.301和0.654倍,显著低于敏感品系;CYP3、TuGSTo1和TuGSTd1基因在二斑叶螨抗性品系中的相对表达量分别为3.296、3.243和6.529倍,均显著高于敏感品系.综上所述,二斑叶螨对甲氰菊酯产生抗性的分子机理,不仅与击倒抗性突变有关,而且也与CCYP3、TuGSTo1和TuGSTd1基因mRNA表达量上升有关.表明二斑叶螨对甲氰菊酯的抗药性存在多重抗性机制.