出血性中风"瘀热证"分子基础及凉血通瘀方对其干预机制研究

出血性中风病情危重,变化多端,是世界上第一位致残原因和第二位致死原因.探讨出血性中风急性期有效的治疗方法对降低病死率、致残率,提高治愈率至关重要.目前西医内科常规治疗出血性中风除脱水降低颅内压、预防应激性消化道出血、控制感染等对症治疗外,尚无疗效确切的新方法,运用中医药防治出血性中风急性期的报道较多,显示出传统医学的独特优势.国医大师-周仲瑛教授认为"瘀热阻窍"是出血性中风急性期的基本病机,并确立了凉血通瘀为基本治疗大法,该法融凉血、散瘀、清热、通腑、通络、开窍诸法于一炉,取得了良好的临床效果.
本论文是国家科技部973计划-"'瘀热'病因在内科难治病发病中的机制及其分子基础研究"项目中的部分研究内容,旨在探讨出血性中风瘀热证的分子基础以及凉血通瘀方的干预机制.
论文总体分为两大部分:
第一部分:文献综述
对出血性中风的一般情况,分子机制研究进展,中医药治疗现状和凉血通瘀方及其活性成分的临床与实验研究进行了概述.
第二部分:实验研究
研究目的:
临床试验部分通过分析比较出血性中风瘀热证与非瘀热证患者检测指标的异同,揭示"瘀热"复合病理因素的特质;并通过比较对照组和试验组患者用药前后凝血与炎症相关指标的变化,探索凉血通瘀法的疗效机制;细胞实验通过建立血管内皮细胞氧化损伤模型,探讨凉血通瘀方含药血清及其活性成分对过氧化氢(H2O2)诱导损伤的血管内皮细胞的保护作用及作用机制,为临床应用提供客观依据.
研究方法:
1、临床试验:运用ELISA法检测凝血相关指标(凝血酶,纤溶酶PAF,SPECAM)和炎症相关指标(IL-1,4,6,8,10,13,TNF-a,HSP70,NF-KB):试剂盒法检测NO、NOS的表达,应用中位数法(M±Q)统计分析瘀热和非瘀热患者之间,对照组和试验组治疗前后、以及凉血通瘀方对瘀热证患者治疗前后的差异,揭示瘀热证的本质,探讨凉血通瘀方疗效机制;并通过基因芯片和实时定量PCR挖掘和验证相关基因(MMP23B、DNAJB14、IL2RA、C1QTNF3、PDGFRB、F8、F2)和信号通路分子的表达情况,寻找作用靶点.
2、药物化学分析:通过HPLC和UHPLC-MS/MS检测凉血通瘀方含药血清中大黄素和大黄酸的浓度,确定大黄酸和大黄素为复方含药血清中的有效活性成分.
3、细胞实验:通过MTT法观察凉血通瘀方含药血清、有效活性成分不同剂量对细胞活性的影响,筛选出药物的有效作用剂量;荧光分析术、电镜和流式细胞术检测不同剂量药物组的细胞凋亡情况;试剂盒法检测各组SOD、MDA、NO和NOS的表达;Rt-PCR和Westemblot法检测相关基因p53、p21和相关蛋白(NF-KB、Caspase3、P21、P53)的表达,探讨凉血通瘀方对血管内皮细胞的保护作用及作用机制.
研究结果:
1、临床试验结果:
(1)、初步揭示了出血性中风急性期瘀热证的分子本质,结果表明:瘀热患者与非瘀热患者相比,血小板活化因子、IL-1、IL-4、IL-10、MMP9和NF-(K)B显著升高;凝血酶活力、IL-6、TNF-a、HSP-70、HSP-27有升高的趋势.基因芯片检测结果显示,瘀热组与非瘀热组比,多条炎症与凝血相关因子编码基因表达上调,差异表达的基因涉及到多条通路,其中主要是炎症相关通路,也有部分凝血相关通路涉及血管生成、细胞凋亡、DNA损伤修复、免疫、细胞周期等信号通路.实时荧光定量PCR结果表明TNFRSF18、CIQTNF3、TNFAIP3、TNFRSF25、TRAFI、DNAJB14、HSF2等基因"瘀热"患者表达显著高于"非瘀热"患者.
(2)、探讨了凉血通瘀方的药效作用及作用机制,结果表明:该方能使瘀热患者凝血酶水平有降低的趋势;降低瘀热患者HSP70和TAT水平;促进瘀热阻窍证患者血管内皮NO的分泌;对多条基因有调控作用;能够下调多个炎症与凝血相关因子编码基因的表达水平,对与p53、p21基因表达有影响,对细胞凋亡相关基因有影响,这些基因涉及凝血、炎症、免疫、细胞凋亡、细胞周期等多条信号通路,实时定量PCR验证表明经凉血通瘀方联合基础疗法治疗后TNFRSF18、CIQTNF3、TNFAIP3、TRAF1、DNAJB14、HSF2等基因表达明显降低了.
2、药物化学分析结果:
HPLC和UHPLC-MS/MS检测结果表明了复方含药血清高、中、低剂量均含有一定的药物成分,含有大黄素和大黄酸两种有效活性成分,为后续实验的开展提供了有力的理论和实验依据.
3、细胞实验结果:
凉血通瘀方对H2O2诱导损伤的血管内皮细胞有一定的保护作用.可以改善细胞形态:促进细胞增殖;抑制细胞凋亡;提升SOD和NOS的活力;提高血管内皮细胞分泌NO的能力;其中中剂量组的药物能显著降低p53、p21基因和NF-KB、P53、caspase-3和P21蛋白的表达,减轻H2O2对血管内皮细胞的损伤.
小于15uM的大黄素和小于lOuM的大黄酸可以拮抗H2O2对血管内皮细胞造成的损伤.促进细胞增殖,并呈现一定的量效关系;提升SOD和NOS酶的活力;增加NO含量和降低MDA的生成,尤其是5.OuM剂量的大黄素和1.25uM的大黄酸作用效果明显,结果表明该剂量药物能抑制内皮细胞发生凋亡,降低P53基因和NF-KB、P53、caspase-3、P21蛋白的表达,保护血管内皮细胞免受损伤,维持其正常结构和功能.
结论:
1、出血性中风"瘀热"患者在凝血系统的激活、脑水肿及炎症发生程度、炎症和凝血相关基因和信号通路分子表达等方面与"非瘀热"患者存在明显差异,揭示了出血性中风急性期"瘀热阻窍证"的本质与凝血、炎症病理的相关性,因血行凝滞不畅导致"瘀",机体炎性反应导致"热"是出血性中风"瘀热阻窍"证的本质.
2、凉血通瘀方影响出血性中风患者凝血和炎症相关指标的表达,缓解血瘀,控制炎症;降低瘀热患者HSP70的表达,改善患者整体状态,减轻机体损伤;增强NO分泌,舒张血管,改善病情;降低TAT水平,减轻继发性病理损害,改善ICH患者的预后;调控与凝血、炎症、免疫和凋亡等有关的基因和信号通路,提高临床治疗效果.
3、凉血通瘀方及其活性成分对H2O2诱导损伤的血管内皮细胞有保护作用,其中中剂量(临床等效量)作用效果好于高、低剂量组,5.0uM剂量的大黄素和1.25uM的大黄酸作用效果较为显著,它们的作用机制主要与抑制内皮细胞凋亡、抑制p53、p21等基因的表达,降低NF-(K)B、P53、caspase-3、P21蛋白的表达有关,我们推测保护血管内皮细胞是凉血通瘀方治疗出血性中风的可能途径之一,而大黄酸和大黄素可能是凉血通瘀方发挥药效的主要活性成分之一.
本研究通过临床和实验研究,以周仲瑛教授的"瘀热"创新学说为指导,进行瘀热相搏证本质的探讨,阐明凉血化瘀治法方药的作用机理,实验对象包括临床标本和体外细胞株;实验用药涉及复方和活性成分;实验选用细胞生物学、分子生物学技术,实验反证了"瘀热"的分子基础,验证了凉血通瘀方的现代机制,本研究具有一定的理论意义和实际意义.