羊布鲁氏菌病iELISA抗体检测方法的建立及布鲁氏菌omp28基因的克隆与表达
Development of An IELISA for Brucella Antibody Detection in Sheep&Goats and Expression of Brucella OMP28
布鲁氏菌病(Brucellosis)是一种重要的人兽共患传染性变态反应疾病,具有重要的公共卫生学意义.免疫接种和准确诊断是有效防控该病的两大重要手段.目前布鲁氏菌病的诊断方法大都是基于LPS抗原建立的,本研究试图建立一种基于LPS抗原,用于羊布鲁氏菌病抗体检测的iELISA方法.为了提高iELISA检测方法的特异性和灵敏性,本研究对OIE手册介绍的热酚水法提取的布鲁氏菌粗制LPS从纯度、产率、活性等方面比较了冷甲醇沉淀法、硫酸铵沉淀法、酶消化处理法对LPS的纯化效果,结果证明酶消化处理的纯化效果最好.用确定的LPS提纯工艺纯化的LPS作为抗原建立羊布鲁氏菌病iELISA抗体检测方法,并对相关反应条件进行了优化,以方阵滴定法对LPS抗原的浓度和待检血清的稀释倍数进行滴定,确定LPS的最佳包被浓度为0.17μg/ml,待检血清的最佳稀释倍数为1:100.通过控制单一变量法对封闭液、封闭时间、待检血清的反应时间、酶标记兔抗羊IgG抗体的稀释倍数及反应时间、显色时间等其它影响反应的因素进行了优化.最终确定相关条件为抗原4℃包被8h,0.4%明胶封闭30min,待检血清37℃孵育l0min, HPR标记兔抗羊IgG抗体稀释40000倍,37℃孵育10min,TMB25℃显色10min.对385份已知背景的羊血清的检测结果统计,用ROC曲线进行分析,确定iELISA检测结果的判定标准为:S/P≥0.2为阳性,S/P<0.2为阴性.依据结果的判定标准,确定检测系统成立的条件为强阳性对照血清O.D.450mm>0.83,弱阳性对照血清O.D.450mm>0.35,阴性对照血清O.D.450mm<0.15.对所建立的iELISA的敏感性、特异性、重复性(批间重复性和批内重复性)、稳定性、符合率等进行评价.结果表明,该方法敏感性高,比SAT和RBPT灵敏度高60-150倍;特异性好,可有效的区分布鲁氏菌与大肠杆菌O:157和都柏林沙门氏菌的交叉感染;重复性良好,批内重复和批间重复性试验结果变异系数均小于10%;稳定性良好,保存期试验结果显示抗原包被板在4℃保存11个月检测结果稳定;对来自不同地区的385份临床血清进行检测并与RBPT和SAT结果比较,结果阳性符合率98.41%,阴性符合率为96.65%.对1932份临床血清样品进行检测,并与RBPT进行比较,总符合率为91.7%,大量文献报道及本研究结果显示,基于LPS抗原检测布鲁氏菌IgG抗体的检测方法不能与小肠结肠炎耶尔森菌0:9IgG抗体区分.OMP28是布鲁氏菌的重要抗原蛋白,而小肠结肠炎耶尔森菌中不含有此蛋白.为开发一种可区分布鲁氏菌与小肠结肠炎耶尔森菌0:9感染的诊断方法,本研究克隆了不同布鲁氏菌的omp28基因并通过序列比对以及在GenBank中BLAST搜索,结果显示,omp28基因在不同种布鲁氏菌中的相似性达到99%以上,本研究还构建了pET32a-omp28表达载体,并对重组表达载体表达产物进行了鉴定和蛋白的纯化,为进一步研究奠定了丛础.
- 作者：
- 王秀丽
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2012年
- 导师姓名：
- 蒋玉文
- 中图分类号：
- R516.7
- 关键词：
- 布鲁氏菌；iELISA；omp28基因
- brucella；iELISA；omp28gene