雄激素受体在波动性高糖致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用及其机制研究
Involvement of Androgen Receptor in Human Umbilical Vein Endothelial Cells Injure Induced by Intermittent High Glucose and Its Possible Mechanisms

男性心血管疾病发病率较绝经前同年龄阶段女性明显为高,即使矫正其它危险因素后,男性性别仍是一个独立的心血管疾病发病的危险因子.但是另有研究显示男性心血管疾病患者中雄激素的水平较无心血管疾病的男性降低,而且体内外研究证明生理剂量的雄激素可以减轻动脉粥样硬化的发生,故雄激素与冠心病发病关系方面的研究尚无定论,雄激素对动脉粥样硬化形成过程的影响也还不清楚.雄激素受体(Androgen Receptor, AR)是雄激素作用的中介物质,雄激素通过与AR结合而发挥其功能,若无AR,则雄激素对组织无刺激反应.性激素受体,包括AR和雌激素受体(ER)α和β,均在重要的血管组织,如血管内皮细胞和血管平滑肌细胞中表达,但是上述细胞中这些受体的表达变化和重要性尚无定论.血糖波动异常是糖代谢紊乱的重要特征之一,其在启动氧化应激、糖尿病并发症等方面较持续高血糖可能起着更重要的作用.血糖波动通过不同代谢途径诱导血管内皮细胞内氧化应激反应,使多种细胞因子激活,通过启动和调节炎性因子的基因转录,介导血管内皮的损伤,最终加速动脉粥样硬化的发展.PI3K/Akt/mTOR信号通路是影响细胞存活的重要通路,在持续高糖或波动性高糖等应激的环境下,细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路将会激活,且起到保护性作用.当阻断该通路后,各种应激引起的细胞损害将会加剧.且既往研究显示AR信号通路与PI3K/Akt/mTOR信号通路存在cross-talk.波动性高糖是否会影响AR在细胞中的表达,雄激素是否能通过AR改善波动性高糖对人脐静脉血管内皮的损伤,且该作用是否是通过PI3K/Akt/mTOR信号通路介导?本研究将通过不同葡萄糖环境体外培养HUVEC,检测细胞损伤及细胞内AR的表达及PI3K/Akt/mTOR信号通路的变化,并通过药物和siRNA阻断或敲低该通路,观察AR是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响波动性血糖对HUVEC的损害.第一部分体外人脐静脉内皮细胞持续性高糖及波动性高糖损伤模型的建立目的:通过体外持续性高糖和波动性高糖诱导人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vascular endothelial cells, HUVEC)损伤,建立HUVEC的持续性高糖及波动性高糖损伤模型,并检测细胞培养上清液中氧化应激/抗氧化应激系统的变化.方法:体外培养HUVEC,首先以不同葡萄糖浓度(分别为5.5mM\10mM30mM、50mM,和5.5mM+甘露醇44.5mM)的培养液培养不同时间(0h、24h、48h、72h),分别采用倒置相差显微镜观察各组细胞形态、生长状态及MTS方法检测细胞增殖活性.确定高糖损伤葡萄糖浓度为30mM后将HUVEC分为正常对照组(葡萄糖浓度为5.5mM,N组)、持续性高糖组(葡萄糖浓度为30mM,C组)和波动性高糖组(葡萄糖浓度为5.5mM,30mM,每12小时波动,F组),用相应的培养液培养不同时间(0h、24h、48h、72h)后使用倒置相差显微镜观察各组细胞形态及生长状态,收集细胞及细胞上清液,分别采用MTS方法检测细胞增殖活性及酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测细胞培养上清液谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-Px)和8-异前列腺素F2a(8-iso)的含量.结果:1、不同糖浓度对HUVEC的损害倒置相差显微镜下,正常对照组与10mM组细胞生长状态良好;30mM、50mM组细胞均发生收缩、变圆、细胞间隙增宽现象,其中50mM组细胞更为明显,且有较多细胞脱落现象.MTS检测发现正常对照组、10mM、30mM组细胞增殖活性(OD值)在72小时内随培养时间的延长逐渐增高.30mM组OD值的增长明显低于5.5mM组(P<0.05,P<0.01),而10mM与5.5mM组比较无明显差异.50mM组OD值在48-72h时间段内,随着时间的延长OD值逐渐下降.葡萄糖5.5mM+甘露醇44.5mM组各检测指标与正常对照组无明显差异(P>0.05).2、倒置相差显微镜下波动性高糖对HUVEC的损害0h及24h时N组、C组和F组细胞均生长状态良好,细胞形态正常.48h时N组和C组生长状态良好,F组细胞形态发生变化,细胞排列紊乱,部分细胞脱落,并形成小片脱失区.72h时N组生长状态良好,C组细胞间隙增宽,胞核模糊,有少量细胞脱落现象;F组损伤进一步加重.3、波动性高糖对HUVEC细胞增殖活性的影响0h和24h时三组细胞MTS法检测OD值比较无显著性差异(P>0.05).48h时C组与N组比较无显著性差异(P>0.05);F组与N组及C组比较,细胞增殖活性显著降低(P<0.01).72h时C组和F组损伤组与N组比较,细胞增殖活性均显著降低(P<0.01);F组与C组比较,细胞增殖活性也显著降低(P<0.01).4、波动性高糖对HUVEC氧化应激/抗氧化应激系统的影响0h和24h时三组间8-iso及GSH-Px含量均无显著性差异.48h时F组与N组比较GSH-Px含量明显降低(P<0.05),但C组与N组比较、F组与C组比较均无显著性差异(P>0.05);F组较N组和C组8-iso含量明显升高(P<0.01,P<0.05), c组与N组比较无显著性差异(P>0.05).72h时C组和F组与N组比较8-iso含量均明显升高(P<0.05),而GSH-Px含量明显降低(P<0.01);F组与C组比较8-iso含量明显升高(P<0.05),GSH-Px含量明显降低(P<0.01).结论:本部分实验建立了HUVEC持续性高糖和波动性高糖损伤的模型,持续性高糖和波动性高糖均能使HUVEC细胞形态受损,影响细胞生长、降低细胞增殖活性、增加脂质过氧化作用并减少抗氧化应激能力.波动性高糖较持续高糖引起的损伤更明显且更早期.第二部分雄激素受体在波动性高糖致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用目的:观察波动性高糖对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中雄激素受体(Androgen receptor, AR) mRNA及蛋白表达的影响,并了解睾酮是否通过AR对波动性高糖引起HUVEC的损伤产生影响.方法:体外培养HUVEC,分为正常对照组(葡萄糖浓度为5.5mM,N组),持续高糖组(葡萄糖浓度为30mM,C组),波动性高糖组(葡萄糖浓度为5.5mM,30mM,每12小时波动,F组),用相应的培养液培养不同时间(0h、24h、48h、72h)后收集细胞.提取细胞mRNA和蛋白,分别采用real-time PCR、western blot和免疫荧光显微镜检测AR的mRNA及蛋白表达的变化.使用1nM,10nM,100nM及1000nM浓度的睾酮(T1,T10,T100,和T1000)及氟他胺(FLU)刺激N组和F组细胞,观察AR表达的变化及其对波动性高糖引起细胞损伤的影响.结果:1.波动性高糖对HUVEC中AR表达的影响0h和24h时三组细胞AR mRNA和蛋白的表达比较无显著性差异(P>0.05).48h时C组与N组比较无显著性差异(P>0.05);F组与N组及C组比较,AR mRNA和蛋白的表达明显降低(P<0.05).72h时C组和F组与N组比较,AR mRNA和蛋白的表达均明显降低(P<0.05;P<0.01),而且F组与C组比较,表达进一步下降(P<0.01).2.不同浓度睾酮对波动性高糖引起HUVEC损伤的影响光镜下观察HUVEC细胞形态显示:N组及F组细胞形态及生长状况如前部分所述.F+T1及F+T10组细胞形态较F组改善,且F+T10组改善更加明显.但睾酮浓度提高至100nM时,细胞损伤加重,当睾酮浓度提高至1000nM时损伤更加明显.MTS法检测表明:各组培养72h后各组与N组比较,相对OD值均明显下降(P<0.01).而F+T1和F+T10组与F组比较,相对OD值明显升高(P<0.05;P<0.01),F+T100组与F组比较相对OD值无显著性变化(P>0.05),F+T1000组与F组比较相对OD值明显降低(P<0.01).各组检测上清液中氧化应激/抗氧化应激系统结果表明:各组与N组比较8-iso含量明显升高,GSH-Px含量下降(P<0.01);F+T10组和F+100组与F组比较8-iso含量明显下降(P<0.01;P<0.05),F+T1组和F+1000组与F组比较8-iso含量无显著性差异(P>0.05).F+T1组、F+10组和F+100组与F组比较GSH-Px含量均明显升高(P<0.01);F+T1000组与F组比较GSH-Px含量明显降低(P<0.05).流式细胞术检测凋亡显示各组与N组比较凋亡率均明显升高(P<0.01);F+T1组、F+10和F+100组与F组比较明显下降(P<0.01或P<0.05),F+1000组与F组比较明显升高(P<0.01).Western Blot方法检测cleaved-caspase3结果显示各组与N组比较cleaved-caspase3表达均明显升高(P<0.01或P<0.05);F+T10组和F+T100组与F组比较明显下降(P<0.01;P<0.05), F+T1组和F+T1000组与F组比较无显著性差异(P>0.05).3.不同浓度睾酮对HUVEC中AR表达的影响F+T1000组与N组比较ARmRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05),其余各组与N组相比明显降低(P<0.01);F+T1组与F组比较AR mRNA和蛋白表达无显著性差异(P>0.05), F+T10组、F+T100组和F+T1000组与F组比较AR mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.01).4.AR介导睾酮对波动性高糖引起HUVEC的损伤产生影响F+FLU组和F+FLU+T10组与F组比较细胞增殖活性、8-iso和GSH-Px含量、早期凋亡率和cleaved caspase3蛋白表达量均无显著性变化(P>0.05).结论:持续性高糖及波动性高糖均能使HUVEC中AR表达下降,而且波动性高糖引起AR表达降低更早期更明显.不同浓度睾酮均能增加HUVEC中AR的表达,且随着睾酮浓度的升高,AR的表达也逐步增加.不同浓度睾酮改善波动性高糖损伤HUVEC的能力不同,10nM存在较好的改善作用,且该作用是通过AR来实现的.第三部分雄激素受体在波动性高糖致人脐静脉血管内皮细胞损伤中的机制研究目的:观察不同葡萄糖环境培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中PI3k/Akt/mTOR信号通路的变化,并探讨雄激素受体(Androgen receptor, AR)介导睾酮是否通过该信号通路影响波动性高糖对HUVEC的损伤.方法:体外培养HUVEC,分为正常对照组(葡萄糖浓度为5.5mM,N组),持续高糖损伤组(葡萄糖浓度为30mM,C组),波动性高糖损伤组(葡萄糖浓度为5.5mM30mM,每12小时波动,F组),用相应的培养液培养不同时间(0h、24h、48h、72h)后收集细胞及细胞培养上清液.提取细胞蛋白,采用western blot检测总Akt、磷酸化Akt (p-Akt)、总mTOR和磷酸化mTOR (p-mTOR)的变化.使用PI3K特异性阻滞剂LY294002、mTOR阻滞剂雷帕霉素、Akt和mTOR的小干扰RNA(siRNA)阻滞和敲低PI3K/Akt/mTOR通路,根据前部分实验结果,选择10nM浓度的睾酮作为处理浓度,将HUVEC分为正常糖浓度组(N)及波动性高糖组,波动性高糖组中又分为波动性高糖无干预组(F)、波动性高糖+睾酮10nM组(F+T10)、波动性高糖+睾酮10nM+LY294002组(F+T10+LY)、波动性高糖+睾酮10nM+雷帕霉素组(F+T10+RAPA)、波动性高糖+睾酮10nM+LY294002+雷帕霉素组(F+T10+LY+RAPA)、波动性高糖+睾酮10nM+Akt siRNA组(F+T10+Akt siRNA)、波动性高糖+睾酮10nM+mTOR siRNA组(F+T10+mTOR siRNA)、波动性高糖+睾酮lOnM+Akt siRNA+mTOR siRNA (F+T10+Akt siRNA+mTOR siRNA),培养72h后留取细胞及细胞上清液进行MTS法检测细胞增殖能力、ELISA法检测氧化应激/抗氧化应激系统、流式细胞术检测早期凋亡率和western blot检测cleaved-caspase3蛋白表达量.结果:1、波动性高糖引起HUVEC中PI3K/Akt/mTOR信号通路的变化0h时三组细胞p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量无显著性差异(P>0.05).24h时F组p-Akt蛋白相对表达量较N和C组明显升高(P<0.05),C组与N组比较无显著性差异(P>0.05);三组间p-mTOR蛋白相对表达量无显著性差异(P>0.05).48h时C组和F组与N组比较,p-Akt蛋白相对表达量明显升高(P<0.05),而C组和F组之间无显著性差异(P>0.05);F组p-mTOR蛋白相对表达量较N和C组均明显升高(P<0.01),C组与N组比较无显著性差异(P>0.05).72h时C组和F组与N组比较,p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均明显升高(P<0.01),且F组与C组比较两者均无显著性差异(P>0.05).2、MTS法检测细胞增殖能力、ELISA法检测氧化应激/抗氧化应激系统、流式细胞术检测早期凋亡率和western blot检测cleaved-caspase3蛋白表达量显示:药物阻断和siRNA敲低PI3K/Akt/mTOR信号通路后睾酮(10nM)改善波动性高糖环境下HUVEC细胞增殖能力、氧化应激/抗氧化应激系统、凋亡的作用均减弱.结论:在持续性和波动性高糖环境下,HUVEC细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活.阻断或敲低PI3K/Akt/mTOR信号通路,睾酮通过AR改善波动性高糖导致HUVEC损伤的作用减弱.