小窝蛋白1对流感病毒增殖的影响及细胞培养流感病毒工艺探索
流行性感冒(流感)作为一种世界性传染疾病严重威胁着人类健康,由于其致病原一流感病毒具有高度变异性、传染性和耐药性等特点,致使长期以来缺乏根治的方法,目前最普遍也最有效的是接种疫苗进行预防.本论文分别以流感的治疗和疫苗生产为背景,研究分析了小窝蛋白1(caveolin-1,简写为Cav-1)对甲型流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)增殖的影响,并对狗肾细胞(Madine-Darby canine kidney,MDCK)培养制备流感疫苗的生产工艺进行了初步探讨.
第一部分着眼于流感的治疗,研究Cav-1在甲型流感病毒增殖过程中的作用.首先使用逆转录病毒介导的RNA干扰技术和瞬时转染技术改变MDCK和鼠胚纤维原(mouse embryonic fibroblasts,MEF)细胞系中Cav-1的表达水平,然后用流感病毒感染细胞,测定感染后一定时间内病毒的感染活性滴度,结果表明Cav-1在MDCK细胞系中对流感病毒的增殖既有促进作用又有抑制作用,而在MEF细胞系中对流感病毒的增殖仅表现抑制作用.其次为了揭示Cav-1对流感病毒增殖调节作用的机理,通过查询流感病毒蛋白氨基酸序列数据库发现几乎所有的人流感病毒离子通道蛋白M2中都存在一个小窝蛋白1结合域(caveolin-1 binding domain,CBD).为探索Cav-1和M2蛋白之间是否存在相互作用,我们构建了M2 EGFP(增强型绿色荧光蛋白,enhanced green fluorescence protein)融合蛋白的表达质粒进行竞争实验,结果表明过量表达M2 EGFP融合蛋白能够降低流感病毒的感染活性.为了阐明CBD在Cav-1/M2结合中的作用,分别将野生型M2和CBD突变的M2蛋白表达质粒转染细胞,之后进行免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation,Co-IP).结果显示,将CBD的三个核心芳香族氨基酸取代为丙氨酸或者删除CBD模体(M2氨基酸序列中47-55位氨基酸)均能削弱Cav-1/M2蛋白间的结合作用.此外,羧基末端截短的M2蛋白中,随着氨基酸长度的缩减,与Cav-1的相互作用也在逐渐减弱.这些研究证实了M2蛋白中的CBD是Cav-1的结合位点.同时,观察到有一部分删除了CBD的M2蛋白以及不含CBD的禽流感病毒M2蛋白能与Cav-1结合,提示在M2蛋白中存在其他的Cav-1结合域.通过荧光显微镜观察感染及转染的细胞中Cav-1和M2蛋白的分布,发现两者主要共定位在浆膜和核周区域,删除了CBD或者完全截去羧基尾域的M2蛋白在细胞中主要均匀分布在细胞质中,表明CBD或包含兼性螺旋的区域在新合成的M2蛋白的定位和转运过程中起着重要作用.M2/Cav-1的相互作用为抗流感病毒感染提供了一条潜在的治疗途径.
第二部分侧重研究流感疫苗的生产,旨在用MDCK细胞取代鸡胚培养流感病毒,开发新型的、安全高效的流感疫苗生产工艺.首先研究比较了六株鸡胚适应型流感疫苗生产株在MDCK细胞中的增殖能力,发现季节性甲型流感病毒株IVR-148的增殖能力最强,而甲3型流感病毒株的增殖量最少.其次从病毒培养的影响因素入手,探索了胰酶、病毒感染复数(multiplicity of infection,MOI)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、人血清白蛋白(human serumalbumin,HSA),以及温度对流感病毒株IVR-148增殖的影响.研究发现FBS对流感病毒的增殖有抑制作用;在病毒培养液中添加BSA能促进流感病毒提前达到较高的血凝滴度,而添加HSA则使病毒产量下降;病毒培养液中含有胰酶时,37℃比34℃更有利于流感病毒的增殖.流感病毒株IVR-148在MDCK细胞中的增殖规律为:病毒的血凝活性滴度在感染后6小时(6 hours post infection,6 h.p.i.)可检测到,在6-12h.p.i.呈现直线增长,31-40 h.p.i.达到峰值,之后进入平台期;同时发现,流感病毒的感染活性在18-24 h.p.i.达到峰值.在优化的实验条件下,IVR-148病毒株在50ml转管中培养的MDCK细胞中增殖可以达到1:1280的血凝滴度,与在鸡胚中增殖获得的血凝滴度相当.在此基础上进行了10L反应器规模的中试放大,IVR-148病毒株的血凝滴度最高达到1:320,培养工艺条件和病毒株均有待进一步优化.
- 作者：
- 孙李靖
- 学位授予单位：
- 中国科学院研究生院
- 专业名称：
- 生物化工
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 2010年
- 导师姓名：
- 苏志国；Manfred Wirth
- 关键词：
- 小窝蛋白1；流感病毒；相互作用；流感疫苗；流行性感冒
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