草鱼源ACE抑制肽的分离纯化及定量构效研究
Isolation, Purification and Quantitative Structure Activity Relationship of ACE Inhibitory Activity Peptides from Grass Carp Protein
本文建立了两种血管紧张素转化酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)抑制肽体外活性检测方法即高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)和可见分光光度法(Visible spectrophotometricy,VSP),对这两种方法进行比较.以草鱼肉为原料,通过碱性蛋白酶水解制备ACE抑制肽,采用超滤、大孔吸附树脂、制备型RP-HPLC分离纯化得到具有较高ACE抑制活性的纯度均一的草鱼肽组分,全自动蛋白质/多肽序列仪测定该组分的氨基酸序列,并用定量构效关系(quantitative structure activity relationship,QSAR)模型探讨了ACE抑制三肽的结构与活性之间的关系.HPLC法检测ACE抑制肽体外活性的色谱条件确定如下:色谱柱,ODS C18分析型色谱柱(5μm 4.6*150 mm);二极管阵列检测器,检测波长,228 nm;流速,0.8 mL/min;流动相A,水(含0.05%TFA);流动相B,乙腈(含0.05%TFA);进样量,20μL;柱温,25℃;梯度洗脱条件:10%~60%B(10 min):60%~10%B(2 min);VSP法检测ACE抑制肽体外活性的显色条件确定如下:喹啉与苯磺酰氯的体积比2.5、显色反应温度30℃、反应时间30 min、无水乙醇添加量3.7 mL、避光放置时间30 min.对HPLC法和VSP法进行比较,发现HPLC法的检测限低于VSP法,而且HPLC法检测ACE抑制肽体外活性的线性、精确度、重复性及其产物的稳定性均比VSP法更高更好.分别用HPLC法和VSP法测定卡托普利、大豆肽和草鱼肽的ACE抑制活性和Ki值,VSP法测定的IC50值分别为O.00206±0.00005μg/mL.192±4.53μg/mL和153±4.29μg/mL,Ki值为7.09 nM,是HPLC法测定结果的1.07、1.07、1.18和1.44倍.采用碱性蛋白酶在pH9.0、温度50℃、酶与底物比48 AU/kg条件下水解草鱼蛋白,以水解度17.25%为水解终点制备草鱼肽,草鱼肽的IC50值为0.872±0.003 mg/mL,肽含量为65.48%.采用超滤、DA201-C大孔吸附树脂柱层析和制备型RP-HPLC对草鱼肽进行分离纯化,得到纯度均一的草鱼肽组分,其IC50值为0.00534±0.00003 mg/mL,运用全自动蛋白质/多肽序列仪测定该组分的氨基酸序列为VAP.VAP的消化稳定性试验表明:胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶不水解VAP.VAP的ACE水解稳定性试验表明:ACE也不水解VAP.VAP的抑制动力学试验表明:VAP是一种ACE抑制剂,其抑制类型为竞争性抑制,抑制剂常数Ki值为3.34 nM.收集已报道的76种不同来源的ACE抑制三肽,以其每个氨基酸侧链的疏水性质、立体性质或侧链体积大小和电荷性质参数以及三肽的疏水性质参数为自变量,三肽的Log(IC50)为因变量Y建立QSAR模型,模型方程为:Y=3.4639+0.0084X1-0.6281X2-0.0025X3+0.8119X4+0.5677X5-0.0107 X6+0.6139X7+0.5338X8-0.0228X9+1.0223X10N=76,R=0.7547,自变量X的解释能力为80.16%,因变量Y的解释能力为42.55%,模型的预测能力为60.30%.QSAR研究结果表明:C末端氨基酸的侧链体积对三肽ACE抑制活性的影响最大.N末端氨基酸的电荷指数小而疏水性大时,三肽ACE抑制活性强,同时该位的氨基酸侧链体积增大有利于提高三肽的ACE抑制活性,满足这些条件的氨基酸主要有Phe.Met.Ile.Leu等氨基酸;C末端和N端起第二位的氨基酸倾向于为侧链体积大而疏水性和电荷指数小的氨基酸,满足这些条件的氨基酸主要有Lys.Pro.Met等氨基酸.
- 作者：
- 王毅梅
- 学位授予单位：
- 武汉工业学院
- 专业名称：
- 粮食、油脂及植物蛋白工程
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2011年
- 导师姓名：
- 陈季旺
- 中图分类号：
- TQ464.7
- 关键词：
- 草鱼；降压肽；ACE抑制活性；分离纯化；定量构效关系
- grass carp；antihypertensive peptides；ACE inhibitory activity；purification；quantitative structure activity relationship