RNA干扰介导的TSPYL5基因沉默对A549细胞凋亡的影响
Down-regulation of TSPYL5 Gene by Small Interfering RNA Induce Apoptosis of A549 Cell
目的:肺癌是近年来发病率最高的恶性肿瘤,而且在各种肿瘤中其发病率的上升速度居首位.在工业发达国家,死于肺癌的患者人数占所有癌症死亡人数总和的29%;我国肺癌发病率亦呈逐年上升的趋势,为各种癌症之最.近年来,对肺癌患者的治疗主要还是化疗和放疗,而这些治疗药物和措施给患者带来极大的痛苦.因此,我们应该从基因的角度阐明肺癌发生、发展的机制并寻找有效的治疗靶点.现代分子生物学技术的发展和应用为肿瘤的基因治疗开辟了新的途径.近年来,类Y染色体编码睾丸特异蛋白基因(TSPY-like)在肿瘤发生、发展中的作用备受人们的关注.TSPYL因编码一组和Y染色体睾丸特异蛋白(Testis-specific protein Y encoded,TSPY)高度相似的蛋白而得名,该基因位于染色体8q22.1,由437个氨基酸组成,分子量约为45kDa,包含6个外显子,在人肺部、胃部和脑组织中均有表达,且其表达与该部位肿瘤的发生发展密切相关.此外该基因对维持细胞形态、活力及其神经系统的稳定有重要的作用,同时与胚胎发育亦有密切的关系.近年有研究发现其家族成员TSPYL5在肺腺癌A549细胞的表达可影响p21WAF1/Cip1蛋白的表达水平,p21WAF1/Cip1蛋白是细胞周期调节的一种重要蛋白,因此TSPYL5在调节细胞周期蛋白表达方面可能具有重要作用,从而与肺癌发生发展及预后有重要关系,但是具体分子生物学机制尚不十分清楚.本研究旨在探讨脂质体转染TSPYL5 siRNA至人腺癌A549细胞,观察转染后A549细胞形态学变化,通过流式细胞仪检测细胞凋亡的情况,用RT-PCR测定TSPYL5基因在mRNA水平的表达,免疫荧光法测定转染前后TSPYL5蛋白的表达.方法:人工合成抑制TSPYL5基因的siRNA片段,通过脂质体转染到A549细胞内,倒置显微镜下观察其形态学变化;流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;RT-PCR检测TSPYL5 mRNA的表达;免疫荧光法检测TSPYL5蛋白的表达.结果:倒置显微镜观察转染前后细胞形态学变化:转染前,细胞贴壁生长,状况良好,多为梭形,大小适中,核仁清晰.转染后48小时,形态不规则,细胞皱缩,贴壁不佳,细胞突起消失.流式细胞术检测细胞凋亡:结果显示,细胞凋亡率TSPYL5 siRNA转染组(27.71±0.46)%,空白对照组(0.37±0.40)%,阴性对照组(0.47±0.37)%.说明转染TSPYL5 siRNA特异性抑制TSPYL5,可以诱导细胞凋亡.RT-PCR检测TSPYL5 mRNA表达,结果显示, TSPYL5 siRNA转染至A549细胞48h后TSPYL5 mRNA表达显著下调,而空白对照组、阴性对照组TSPYL5的mRNA表达无明显变化.说明TSPYL5 siRNA可特异性阻断TSPYL5mRNA表达.免疫荧光检测TSPYL5蛋白表达,转染前各组蛋白表达明显,呈铺路石样分布;转染后蛋白表达显著下降.结论:利用RNA干扰技术沉默TSPYL5基因可以显著促进A549细胞的凋亡.为进一步研究采用RNA干扰技术进行肺癌的生物学治疗奠定了基础.
- 作者：
- 王莹莹
- 学位授予单位：
- 大连医科大学
- 专业名称：
- 呼吸内科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2011年
- 导师姓名：
- 王衍富
- 中图分类号：
- R734.2
- 关键词：
- 类Y染色体编码睾丸特异蛋白基因5；siRNA；肺癌
- TSPYL5；SiRNA；Lung carcinoma