红豆杉内生真菌代谢产紫杉烷类物质的研究
Study on Metabolites of Taxanes-producted by Endophytic Fungi from Taxus Chinensis
近年来,利用红豆杉内生真菌发酵生产紫杉醇是研究的热点,国内外学者对其进行了大量的研究工作,分离并鉴定有200多株内生真菌可以产紫杉醇,但是研究结果显示,其紫杉醇的产量很低.寻找高产菌株、优化培养条件及研究代谢调控是提高生物活性物质产量及解决紫杉醇资源短缺的一条有效途径.本文以从秦巴山区红豆杉中分离的82株内生真菌为研究对象,进行定性分析,筛选产紫杉醇、巴卡亭Ⅲ(BaccatinⅢ)和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DAB)内生真菌,并在此基础上,研究了液体发酵和生长调节剂对紫杉烷类物质的代谢影响.主要研究方法和结果如下:1.采用HPLC及HPLC-MS检测方法,对分离的82株内生真菌的发酵液提取物进行检测.结果表明,有11株内生真菌代谢产生紫杉醇,占内生真菌总数的13.4%;19株内生真菌代谢产BaccatinⅢ,占内生真菌总数的23.2%;9株内生真菌产10-DAB,占内生真菌总数的10.9%.2.在代谢活性成分分析时发现,内生真菌LB-5次生代谢产物包含紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB,其产量分别为314.29μg/L,565.72μg/L和573.94μg/L.结合形态学特性和ITS序列分析,鉴定该菌株为根霉菌(Rhizopus sp.).3.培养基中的碳氮源是菌体生长和次生代谢产物累积的主要营养成分,用HPLC检测方法跟踪检测紫杉醇产量,筛选了最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是硝酸铵.通过实验,确定了葡萄糖、硝酸铵的最适浓度,即葡萄糖40.0g/L,硝酸铵6.0 g/L.从而得到发酵培养基组成(g/L):葡萄糖40.0,NH4NO3 6.0,MgSO4 0.3,KH2PO4 0.5,VB1 10*10-2.4.根据紫杉醇的结构特点和红豆杉中紫杉烷的合成机制,选取赤霉素(GA3)、茉莉酸甲酯(MeJA)、矮壮素(CCC)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)作为生长调节剂,在发酵第7d加入,采用干重法研究其对LB-5菌体生长的影响,HPLC法跟踪监测紫杉醇产量.实验结果表明,GA3、MeJA、CCC、6-BA和NAA均可提高紫杉醇的产量.但GA3、MeJA和CCC对菌丝体的生长有明显的抑制作用;6-BA和NAA对菌丝体的生长均有促进作用.5.GA3、MeJA、CCC、6-BA和NAA均可提高紫杉醇的产量,针对GA3、MeJA、CCC、6-BA和NAA的生理作用,分别选取不同的浓度范围,研究其对紫杉醇的产量的影响.结果表明:补加GA3浓度为4 mg/L时,紫杉醇产量达到最高.此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为670.49μg/L、413.55μg/L和410.94μg/L;补加MeJA浓度为60μmol/L时紫杉醇产量达到最高,此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为838.11μg/L、179.36μg/L和165.31μg/L;补加CCC浓度为25 mg/L时紫杉醇产量达到最高,此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为942.57μg/L、102.35μg/L和98.59μg/L;补加6-BA浓度为4 mg/L时紫杉醇产量达到最大值,此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为455.72μg/L、402.63μg/L和403.91μg/L;补加NAA浓度为4 mg/L时,紫杉醇的产量达到最高,此时紫杉醇、BaccatinⅢ和10-DAB的产量分别为450.46μg/L、408.31μg/L和410.12μg/L.6.随着植物调节剂浓度的增加,生物合成反应向着有利于紫杉醇生成的方向进行,而BaccatinⅢ和10-DAB的产量的随着下降,当它们的浓度达到彼此对紫杉醇所能影响的最大程度时,紫杉醇的产量达到峰值,而BaccatinⅢ和10-DAB的量也达到最低值,当其浓度继续增大时,紫杉醇的产量开始降低,BaccatinⅢ和10-DAB的产量开始增大,由此说明植物调节剂对紫杉醇产量的影响与对BaccatinⅢ和10-DAB的产量的影响呈现反比关系,据此可以印证化学合成中BaccatinⅢ和10-DAB为紫杉醇的前体物质的结论.
- 作者：
- 李娟花
- 学位授予单位：
- 陕西理工学院
- 专业名称：
- 植物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2011年
- 导师姓名：
- 邓百万
- 中图分类号：
- R734.2
- 关键词：
- 红豆杉；紫杉烷；内生真菌；发酵条件；代谢调控
- Taxus；Taxane；Endophytic fungi；Fermentation condition；Metabolism control
- 基金项目：
- 陕西省教育厅项目