奶牛Cathelicidins抗菌肽Bac5基因的克隆、表达及抑菌活性分析
Cloning and Expression of Cathelicidins Bac5 from Dairy Cattle and the Antimicrobial Activity Analysis
近年来,由于长期乱用和滥用抗微生物药物,使耐药性问题日益严重,增加了动物疾病的防治难度,同时引起了动物产品抗生素残留,严重影响了动物性食品安全.因此,研究和开发新型安全、有效和环保的抗菌药物已迫在眉睫.抗菌肽广泛存在于动植物体内,在机体的先天性免疫和获得性免疫中发挥着重要作用,加之对耐药菌株强大的抗菌作用而倍受关注.牛Bac5是一种具有延伸螺旋结构的强效阳离子抗菌多肽,属于Cathelicidins抗菌肽,在牛机体抵抗外来病原体入侵方面具有重要作用.传统的从牛机体组织中提取Bac5的方法具有操作复杂、成本高、产量低、不能规模化生产等缺点.因此,借助于基因工程技术来获取Bac5重组蛋白有望解决该难题,并已成为开发新型环保抗菌制剂的新的发展方向.本研究依据GeneBank中收录的牛Bac5基因序列设计并合成1对特异性引物,采用RT-PCR技术从荷斯坦小公牛骨髓总RNA中成功扩增出去信号肽的Bac5基因片段,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后定向亚克隆至pET28a原核表达载体中,构建pET28a-Bac5重组表达质粒,再将重组质粒转化至E.coli DH5α.在含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中筛选阳性克隆,经PCR扩增、双酶切及序列测定后,将重组表达质粒pET28a-Bac5转化至E.coli Rosetta,筛选阳性克隆,并再次进行PCR和测序鉴定,将鉴定为阳性的菌液以IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定诱导表达产物,并利用大肠杆菌O111(CVCC1450)和金黄色葡萄球菌(CVCC545) 2种标准菌株和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌3种乳房炎乳常见分离菌株对表达的Bac5重组蛋白进行抑菌活性的初步鉴定.结果表明,本研究从牛骨髓中成功扩增出目的片段,并成功构建了pET28a-Bac5重组表达质粒,测序结果显示插入的目标基因片段大小为414bp,编码137个氨基酸残基,与GeneBank中收录的牛Bac5基因序列(L02650.1)的同源性为100%,且开放阅读框正确.经IPTG诱导后得以表达,表达产物经SDS-PAGE鉴定,分子量约为19 KD,与理论预测大小一致.抑菌试验结果表明,乳房炎乳3种常见分离菌株对青霉素、链霉素具有一定的耐药性,而对Bac5重组蛋白较为敏感;Bac5重组蛋白对2种标准菌株均表现出较强的抑菌活性.本研究为奶牛乳房炎的临床治疗和新型环保抗菌制剂的研制及开发奠定了基础.
- 作者：
- 杨利恒
- 学位授予单位：
- 甘肃农业大学
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2011年
- 导师姓名：
- 薛慧文
- 中图分类号：
- S823
- 关键词：
- 奶牛；Cathelicidins抗菌肽；Bac5；基因克隆；原核表达；抑菌活性
- dairy cattle；Cathelicidins antibacterial peptide；Bac5；gene clone；prokaryotic expression；antimicrobial activity