液体高分辨核磁共振在蛋白质研究中的方法及其应用
Methodology and applications of high resolution NMR in protein studies
本论文围绕液体高分辨核磁共振技术在蛋白质研究中的一些方法和应用展开研究工作.内容包括NMR实验技术的改进,NMR在蛋白质分子动力学以及蛋白质与配体相互作用研究中的应用. 1.对近期液体高分辨核磁共振技术在蛋白质研究中的方法和应用方面的迅速发展(第一章),尤其是在蛋白质与配体之间的相互作用方面(第四章)进行了综述.简要概括了本论文所应用的蛋白质NMR谱学的基本原理(第二章). 2.研究了TCS-C7蛋白在溶液中的分子动力学性质.首先对TCS主链进行了顺序归属.其次发展了CLEAN SEA-HSQC脉冲序列,该技术可以选择性只检测与溶剂有交换的残基NH信号,而且不需氘代样品同样可以避免混合时间内由于纵向弛豫,及通过交换产生的来自于羟基,氨基质子的NOE杂信号的影响.将该技术应用于对TCS-C7的研究中,并与TCS-C7的溶剂接近度相对照,结果表明TCS-C7在溶液中的三维结构与已报道的晶体结构非常相似.进一步对其主链〓N的弛豫和〓H-〓N的NOE数据进行分析,得到了残基水平的分子动力学信息.(第三章) 3.随着蛋白质与配体结合研究的深入,开展了多个配体与单个蛋白相结合的研究.通过观测小分子配体的化学位移和纵向弛豫时间,对两个药物小分子配体(布洛芬与水杨酸)与人血清白蛋白(HSA)的竞争性结合进行了分析.由于竞争结合,当体系中一个配体浓度升高时会引起另一配体的游离态浓度增大,表现为化学位移向低场移动和弛豫速率降低.结果表明这两个配体在HSA分子上有一些共同的低亲和性结合位点.对于快交换体系,化学位移或弛豫速率的观测值是自由态与结合态配体的表观平均值,因而得以计算出结合态配体的浓度.(第五章) 4.设计了横向弛豫加权的ROESY(CPMG-ROESY)实验,并用以表征两种配体与蛋白质的竞争结合及共结合.两种不同配体与蛋白质的共结合及竞争结合方式都会产生配体之间的ROE(IL-ROE).配体间共结合产生的IL-ROE的相对大小反映出配体之间的空间距离及与蛋白结合时的相对取向.但是,竞争结合会经由蛋白质的质子产生间接转移的IL-ROE,与共结合产生的直接的IL-ROE混在一起,影响结合态配体间的相对取向的确定.针对这一现象,我们设计了横向弛豫加权的ROESY实验,将两种来源的IL-ROE区分开.这一方法根据小分子自由态配体与结合态配体及蛋白质之间的横向弛豫时间相差很大,在ROE产生的混合时间之前,用一段横向弛豫延迟(通过CPMG序列实现)使蛋白质的磁化矢量完全衰减,从而切断间接转移的IL-ROE途径.以布洛芬及水扬酸与人血清白蛋白结合体系为模型体系验证了这一方法,其中布洛芬H10和水杨酸S3,5质子之间的间接IL-ROE在混合时间为275毫秒时大约为10-20％.(第六章) 5.研究了CA〓缺乏的钙调蛋白(APOCAM)与NEUROGRANIN结合域IQ多肽配体的相互作用.在APOCAM及其与IQ的复合物进行主链顺序归属的基础上,首先应用浓度滴定与化学位移微扰方法证实了:A)结合区和构象变化区主要发生在APOCAM的C-末端;B)在APOCAM的EF手1和2及3和4之间的连接区(40-44残基,112-117残基),及α-螺旋H的末端(145-148残基)可能参与结合.计算出该结合反应的解离常数为3~6*10〓M,说明属于弱结合.通过CLEAN SEA-HSQC实验,进一步确定上述可能结合区在结合后与水的交换变弱,的确是主要结合区.同时发现变构效应引起的化学位移变化发生在45-57残基等位置.(第七章)
- 作者：
- 崔艳芳
- 学位授予单位：
- 中国科学院武汉物理与数学研究所
- 专业名称：
- 无线电物理
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 2003年
- 导师姓名：
- 刘买利
- 中图分类号：
- O561
- 关键词：
- 核磁共振；蛋白质；液体高分辨核磁共振
- high resolution NMR； protein； multidimentional NMR spectroscopy； protein-ligand interaction； ILOE； Trichosanthin； CPMG-ROESY； Calmodulin； Clean SEA-HSQC； backbone dynamics of protein； resonance assignment