蛋白质的高效疏水作用色谱与磁性亲合分离技术研究
随着生物技术的发展,蛋白质的分离纯化技术在近几年得到了巨大的进步,许多新的纯化技术相继问世.但如何从理论和实验上去完善这些新的分离方法就成了人们十分关注问题.在论文中,我们重点研究了蛋白质的高效疏水作用色谱(HPHIC)技术及其磁性亲合分离技术(MAMS). 一.蛋白质的高效疏水作用色谱技术 蛋白质的HPHIC是近几年中发展非常迅速的分离技术,尤其是对基因重组蛋白质纯化表现出了得天独厚的优势,它既可以使重组蛋白质进行分离又可以使其得到复性,因此倍受重视.在这一部分研究中,我们分三方面对蛋白质的HPHIC技术进行了研究. 1.合成了四个端基不同的疏水填料,用它们对标准蛋白质进行了分离,通过研究温度和柱子疏水性对保留时间的影响,证实了合成的柱子符合HPHIC的特点.该柱可以使蛋白质的活性回收率接近100％,重复使用1000次柱效无明显降低.通过元素分析,证实合成方法具有较好的重现性. 2.在优先水化作用和相关作用原理基础上,从热力学出发推导出了蛋白质在HPHIC上新的数学保留模型,使过去观察到的经验规律有了理论依据.新模型中一个重要的数学表达式为:〓为容量因子,〓为水的摩尔浓度,1QI是一个反映蛋白质与配体间亲和势大小的一个常数,Z为计量置换因子,表示从固定相表面置换掉一个蛋白质时所需水的分子个数.该式无论在任何条件下都具有非常好的线性关系.另一个重要的数学表达式为:〓与柱子的疏水性密切相关,1.74为1QI和对Z作图的斜率,无论在任何条件下总存在这种关系,它是HIC的一个重要的色谱特征.上述两方程式可以解释许多重要的蛋白质在HPHIC上的保留行为.通过新模型参数与HPHIC常用的KARGER和HORVATH方程进行比较,证实新模型的适用范围更广,各种参数都具有十分明确的物理意义.新模型中的参数Z与HORVATH方程的S值结合-Z/S可以用来预计蛋白质在HPHIC上进行梯度洗脱时的保留次序和保留时间. 3.利用合成的HPHIC柱对三种不同的基因重组人干扰素(RHIFN)进行了分离纯化.E.COLI表达的RHIFN-γ、YEAST表达的RHIFN-α和E.COLI表达的RHIFN-α经HPHIC一步纯化后的纯度分别为80％、70％和30％,远高于除亲合色谱外的其它纯化方法.合成的柱子不但可以分离蛋白质还可以在分离同时进行蛋白质的复性条件研究,E.COLI表达的RHIFN-α和RHIFN-γ在经HPHIC分离后的生物学活性比通常的稀释复性高4倍以上.将HPHIC与排阻色谱法相结合建立了一套简单、快速和方便的RHIFN-γ纯化新工艺,经两步色谱纯化方法就可以使RHIFN-γ的纯度达到95％以上. 二.蛋白质的磁性亲合分离技术 蛋白质的磁性亲合力分离技术是近几年才出现的一种蛋白质分离新方法.它是将亲合色谱技术同磁性材料在磁场的引导下可定向移动相结合制备的一种新的蛋白质分离技术,目前无论在理论还是在实验方面都十分不完善,如何将磁性亲合分离技术用于蛋白质的分离有许多工作要做.在这一部分我们进行了如下研究: 1.利用化学反应合成了四氧化三铁(〓)磁性物质,通过琼脂糖(AGAROSE)在形成微球时将〓包裹在微球中,形成磁性载体,再通过溴化氰(CNBR)活化法将RHIFN-α和RHIL-2单克隆抗体(MCAB)偶联在磁性载体上制备了磁性亲合单抗载体. 2.利用MAMS成功地对E.COLI表达RHIFN-α和基因重组人白细胞介素-2(RHIL-2)进行了直接纯化.纯化后RHIFN-α纯度为88.4％,比活性为1.0 *〓IU/MG蛋白质,活性回收率为70％.RHIL-2纯化后的纯度为91％,比活性为2.0 *〓IU/MG蛋白质,活性回收率为75％.实现了直接从浑浊溶液中快速、高效、简单分离蛋白质的目的,大大提高了工作效率. 3.利用淀粉作配体制备了磁性亲合载体,并纯化了基因重组的α-淀粉酶. 在研究论文中对蛋白质分离技术有所发展的方面为: 1.在优先水化作用和相关作用原理基础上结合热力学推导出了蛋白质在HPHIC上新的数学保留模型,使过去观察到的经验规律有了理论依据.新的模型参数可以用来预计蛋白质在HPHIC上的梯度洗脱保留时间和保留顺序. 2.建立了一套简单实用的RHIFN-γ纯化新工艺. 3.建立了一套磁性亲合分离技术路线,并成功地将其用于RHIFN-α、RHIL-2和α-淀粉酶的纯化中.
- 作者：
- 郭立安
- 学位授予单位：
- 上海医药工业研究院
- 专业名称：
- 微生物药学
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 1998年
- 导师姓名：
- 朱宝泉；陈代杰
- 关键词：
- 生物化学分析；蛋白质；疏水作用色谱；磁性分离；亲合分离
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