蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞L-型钙通道及细胞内游离钙离子浓度的影响

目的：建立人视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelium,RPE)蓝光损伤模型,探讨L-型钙通道是否参与蓝光致人RPE细胞光损伤过程,蓝光照射与钙通道中心脏亚型(α1C或Cav1.2)、神经内分泌亚型(α1D或Cav1.3)和视网膜亚型(α1F或Cav1.4)mRNA表达之间的关系及RPE细胞内游离钙离子浓度是否发生变化。
　　 方法：将第四代人RPE细胞随机分为四个组,用2000±500Lux蓝光强度分别照射细胞3h、6h、9h和12h,24h后终止细胞培养,采用TUNEL法检测细胞凋亡,确定最适宜光照时间。将体外培养的第四代人RPE细胞随机分为四组,无光照组、光照组、光照+硝苯地平组、光照+(-)BayK8644组。用2000±500Lux蓝光照射6h,24h后终止细胞培养。用Real-TimeRT-PCR与荧光定量PCR技术分析各组人RPE细胞L-型钙通道中心脏亚型(α1C或Cav1.2)、神经内分泌亚型(α1D或Car1.3)和视网膜亚型(α1F或Cav1.4)mRNA的表达。将第四代人RPE细胞分为六组:无光照组、光照组、硝苯地平组、光照+硝苯地平组、(-)BayK8644组、光照+(-)BayK8644组。蓝光分别照射RPE细胞6h,终止细胞培养24h,采用激光共聚焦显微镜检测细胞内游离钙离子浓度,激发波长488nm,发射波长505nm,每组随机选取30个细胞,扫描细胞图像,采用分析软件分析细胞内游离钙离子荧光强度。用单因素方差分析各组荧光强度差异。
　　 结果：24h终止培养组,光照6h,9h及12h的凋亡指数(apoptoticindex,AI),与对照组及3h组比较,有显著的差异性(p＜0.01)。荧光定量PCR产物α1C、α1D、α1F和内参ATCB的cDNA分子量分别为68bp、157bp、125bp和186bp,产物的凝胶电泳结果显示扩增条带位置与以上分子量相吻合。(1)各组α1CmRNA的表达,光照组、光照+硝苯地平组、光照+(-)BayK8644组αlCmRNA的表达均高于无光照组,差异有统计学意义(P=0.002,0.001,0.000);光照+硝苯地平组、光照+(-)BayK8644组α1CmRNA的表达均高于光照组,差异有统计学意义(P=0.003,0.000),光照+(-)BayK8644组α1CmRNA的表达高于光照+硝苯地平组,差异有统计学意义(P=0.004)。(2)各组α1DmRNA的表达,光照组、光照+硝苯地平组、光照+(-)BayK8644组α1DmRNA的表达均高于无光照组,差异均有统计学意义(P=0.023,0.006,0.010);光照+(-)BayK8644组与光照组和光照+硝苯地平组比较均有统计学意义(P=0.032,0.039);光照+硝苯地平组与光照组比较无统计学意义(P=0.459)。(3)各组α1FmRNA的表达,光照组、光照+硝苯地平组、光照+(-)BayK8644组与无光照组比较均有统计学意义(P=0.010,0.000,0.002);光照+硝苯地平组、光照+(-)BayK8644组α1FmRNA的表达均高于光照组(P=0.000,0.005),光照+(-)BayK8644组与光照+硝苯地平组比较均无统计学意义(P=0.585)。激光共聚焦显微镜结果显示,光照组、光照+硝苯地平组、(-)BayK8644组、光照+(-)BayK8644组RPE胞内钙离子荧光强度高于无光照组,差异有统计学意义(P=0.000,0.000,0.000,0.000),硝苯地平组RPE胞内游离钙离子荧光强度比无光照组低,差异有统计学意义(P=0.000),硝苯地平组与光照+硝苯地平组比较,差异有统计学意义(P=0.000),光照+硝苯地平组与光照组相比较,(-)BayK8644组与光照+(-)BayK8644组比较,差异均无统计学意义(P=0.204,P=0.103).
　　 结论：(1)光照强度2000±500Lux,光照6h,24h终止培养为建立蓝光照射致人RPE细胞光损伤模型最适合条件;(2)蓝光照射可引起L-型钙通道中α1C、α1D及α1F亚型mRNA表达不同程度的增高,10-5M肖苯地平不能对抗蓝光照射作用而降低人RPE细胞α1D亚基mRNA表达,而钙通道激动剂(-)BayK8644起到相反的作用,L-型钙通道可能参与蓝光致RPE细胞损伤过程;(3)蓝光照射人RPE细胞可引起细胞内游离钙离子浓度增加;(4)蓝光照射对RPE细胞上L-型钙通道的开放作用强于10-5M硝苯地平的阻滞作用。