温度影响体外培养大鼠精原细胞SCF/c-kit增殖通路及细胞周期
目的:通过在不同温度下体外培养大鼠生精细胞,探讨温度对精原细胞SCF/c-kit增殖通路及细胞周期的影响,为进一步研究体腔温度(37℃)导致精子发生障碍的机制提供基础研究资料。
方法:采用机械法和酶消化法分离雄性成年SD大鼠生精细胞,分别置于不同温度(32℃、37℃)条件下与支持细胞进行体外共培养,观察其形态及细胞数变化等生长特性:培养第8天利用非连续密度梯度离心、差异性贴壁分离富集A型精原细胞:流式细胞技术检测细胞周期:实时定量.多聚酶链反应(Realtime-PolymeraseChainReaction,RT-PCR)和蛋白免疫印迹(WesternBlot)分别检测SCF/c-kit增殖通路中c-kit及下游基因PI3K、CyclinD3mRNA和蛋白的表达;Sanger双脱氧法检测c-kit基因第9、11、13号外显子序列。
结果:体外共培养第1天,32℃组、37℃组均可见悬浮的呈圆形或卵圆形的生精细胞和贴壁的呈长梭形或不规则形的支持细胞;前3天,生精细胞数及生长状态没有明显的区别,从第4天开始,37℃组的生精细胞数、生长状态逐渐降低,第4天时,37℃组的生精细胞数为3.11±0.18×106/ml,32℃组为3.40±0.25×106/ml,第8天时,37℃生精细胞数为0.49±0.25×106/ml,明显低于32℃组的2.93±0.26×106/ml,差异有统计学意义(P＜0.05):体外共培养第8天,percoll分离结合差速贴壁法成功分离富集出A型精原细胞,流式结果显示32℃组处于S期A型精原细胞所占比例为49.35±1.04,明显高于37℃组的43.58±0.78;G0/G1期为40.99±0.76,明显低于37℃组的46.45±0.92,差异有统计学意义(P＜0.05);实时定量.多聚酶链反应(RT-PCR)及蛋白质免疫印迹(WesternBlot)检测结果显示:32℃组和37℃组A型精原细胞中均有c-kit、PI3K及CyclinD3mRNA和蛋白的表达,且32℃组中A型精原细胞c-kit、PI3K及CyclinD3mRNA和蛋白的表达量均高于37℃组,差异均有统计学意义(P＜0.05);基因测序结果显示32℃组c-kit基因第9、11、13号外显子均未见突变,37℃组第11、13号外显子未见突变,第9号外显子见套峰,提示在9号外显子附近区域可能有缺失或插入突变。
结论:在含有FBS的DMEM/F12基础培养基中体腔温度(37℃)影响体外培养大鼠精原细胞的增殖,同时可能导致c-kit基因发生突变;37℃这种近似体腔的温度不宜用于研究体外培养体系中精原细胞正常增殖和分化。
- 作者：
- 邓呈亮
- 学位授予单位：
- 遵义医学院
- 专业名称：
- 整形外科
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2011年
- 导师姓名：
- 王达利
- 中图分类号：
- R698.2；R329.2
- 关键词：
- 精原细胞；体外培养；细胞周期；基因突变；增殖通路
- rat；spermatogonial cells；in vitro；c-kit；cell cycle；gene mutation