缺氧预处理MSCs移植对心肌梗死区SDF-1/CXCR4轴表达变化的实验研究

目的：研究骨髓间充质干细胞(MSCs)及缺氧预处理MSCs在SD大鼠急性心肌梗死模型梗死局部注射后梗死区域基质细胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4表达变化以及对梗死后心功能改善的作用,并对其机理及意义进行探讨。
　　 方法：全骨髓法分离培养SD大鼠MSCs,通过体外培养和连续传代达到纯化和扩增MSCs目的。倒置显微镜下观察细胞形态变化情况;利用四唑盐比色法(MTT)测定MSCs的生长曲线;流式细胞仪(FCM)鉴定MSCs膜抗原。其中部分MSCs在术前24h作预缺氧处理,体外实验分别测定普通培养MSCs和预缺氧培养MSCs中的SDF-1和CXCR4含量。128只SD大鼠,随机分为MSCs移植组(MSCs组,n=32)、缺氧预处理MSCs移植组(预处理MSCs组,n=32),结扎冠状动脉左前降支制备急性心肌梗死模型,结扎左前降支冠状动脉10min后,在梗死区域、梗死区边缘局部注射共约0.5×106uL-1个MSCs和预缺氧处理后的MSCs。取32只为对照组,仅结扎左前降支冠状动脉。其余32只SD大鼠作为假手术组。心肌梗死前及梗死后28d采用超声心动图测量LVDd、LVDs、EF三项反应心脏功能指标。分别于术后1d、7d、14d和28d每组各处死8只大鼠取心脏组织作免疫组化、RT-PCR、常规病理染色等项目检查。测定不同时期SDF-1/CXCR4在各组梗死心肌局部表达值的变化,同时测定心肌梗死面积、梗死区心室壁厚度和心室肌内微血管密度。
　　 结果：成功培养MSCs,取第4代MSCs进行FCM检测,CD45、CD90、CD29阳性率分别为1.50％、99.18％、97.70％。MSCs体外试验显示有SDF-1mRNA和CXCR4mRNA表达,其中SDF-1mRNA缺氧预处理组表达是正常MSCs的1.20倍,而CXCR4mRNA表达值是正常MSCs组的1.47倍。MSCs体外SDF-1和CXCR蛋白荧光定量SDF-1低氧组为108.54±1.79,正常组为26.08±1.28(P＜0.05);CXCR4低氧组为135.50±1.19,正常组为28.13±1.02(P＜0.05)。成功建立SD大鼠急性心肌梗死模型,手术存活率为95％。免疫组织化学及激光共聚焦显示,移植MSCs后SDF-1和CXCR4在梗死周边区域注射细胞处及局部血管壁发生高表达,且SDF-1mRNA、CXCR4mRNA在移植后24h后达高峰,持续约7d,以后逐渐递减;SDF-1、CXCR蛋白荧光定量在移植后7d达高峰,以后逐渐递减。其中预处理MSCs组SDF-1和CXCR4的表达在有各时间点又均显著高于MSCs组(P＜0.05)对照组心梗后SDF-1和CXCR4值升高,与假手术组比较有显著性差异(P＜0.05),假手术组心肌组织中有SDF-1和CXCR4的少量表达。心肌梗死后28d时超声心动图结果表明MSCs组和预处理MSCs组LVDd、LVDs、EF三项反应心脏功能指标均较对照组明显改善(P＜0.05),其中预处理MSCs组又显著优于MSCs组(P＜0.05)。与对照组比较,梗死面积缩小程度最显著为预处理MSCs组,其次为MSCs组,三者之间均有显著差异(P＜0.05)。左室前壁厚度在预处理MSCs组、MSCs组和对照组依次为3.56±0.45mm、2.88±0.32mm和1.80±0.71mm,各组间差异均有显著性(P＜0.05)。心肌梗死区、心肌梗死边缘区及正常心肌组织三个部位CD31新生微血管数量测定MSCs组和预处理MSCs组均较对照组明显增加(P＜0.05),其中预处理MSCs组又显著高于MSCs组(P＜0.05)。
　　 结论：全骨髓贴壁法能有效得到分离纯化的MSCs,MSCs生长稳定,增殖能力活跃,具有MSCs的一般生物学特性,可以作为组织工程理想的种子细胞。MSCs在体外普通或缺氧两种方法培养条件下SDF-1/CXCR4均有表达,且缺氧预处理组高于正常培养组,说明缺氧条件能促进MSCs高表达SDF-1和CXCR4。MSCs在心肌梗死区域注射后可提高局部组织内SDF-1和CXCR4表达,而经预缺氧处理MSCs移植后局部SDF-1和CXCR4表达最高,SDF-1和CXCR4在心肌梗死区域局部的高表达可能会诱导外周血、骨髓内及其他组织中干细胞向心肌梗死区域转移,促进新生毛细血管,这可能是MSCs治疗急性心肌梗死的机制之一,也可能是缺氧预处理MSCs改善心功能更好的原因之一。未移植MSCs心肌梗死组中梗死区域局部也有一定SDF-1/CXCR4表达升高,这可能是心肌梗死后机体调动外周干细胞定向迁移参与损伤心肌修复的途径之一。在将来的缺血性心脏病基础及临床研究中,可能通过调控局部SDF-1/CXCR4表达或外源性应用SDF-1,有望对改善受损心脏心功能发挥有益作用。