氯胺酮对大鼠相关脑区兴奋性神经递质的影响
Effects of Ketamine on Excitatory Neurotransmitters Levels in Rat Relevant Brain Area

目的:1.探索最佳提取分离、衍生化方法和色谱条件,选择合适的内标物,建立大鼠脑区兴奋性神经递质谷氨酸(glutamic acid, Glu)、天冬氨酸(aspartic acid, Asp)、甘氨酸(glycine, Gly)和亮氨酸(leucine, Leu)的高效液相色谱(high-performance liqid chromatography, HPLC)同时定量分析方法.2.用所建立的方法,同时测定注射氯胺酮后大鼠脑区的前额叶皮质、海马、杏仁体和乳头体中的Glu、Asp、Gly和Leu含量.3.对实验数据进行统计学分析,阐明氯胺酮对大鼠相关脑区兴奋性神经递质的影响水平.4.探讨氯胺酮病理生理作用与大鼠相关脑区的兴奋性氨基酸含量变化之间的联系.方法:1. HPLC法同时测定注射氯胺酮后的大鼠脑区的前额叶皮质、海马、杏仁体和乳头体中兴奋性神经递质Glu、Asp、Gly和Leu的含量.以超纯水与无水乙醇的混合溶剂(4:1,V/V)超声萃取大鼠脑组织中的Glu、Asp、Gly和Leu.以正亮氨酸(norleucine, Nor-leu)为内标物,正亮氨酸和提取物用乙腈、三乙胺(triethylamine, TEA)和异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate, PITC)的混合溶剂(8:1:1,V/V/V)衍生化,以0.1mol/L醋酸钠溶液(加冰醋酸调pH为5.4)和乙腈作为流动相进行梯度洗脱.采用保留时间定性,内标工作曲线法定量.2.按随机数字表分组,将54只健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为空白对照组(n=6)、生理盐水对照组(n=6)和实验组.实验组分为连续注射氯胺酮3d、5 d、7d、9d、11d、13d和15d共7个组,每组n=6.分别对每组动物进行编号.生理盐水对照组和实验组大鼠均腹腔注射给药,并于末次给药后15min处死.所有大鼠对照其脑立体定位谱图,快速分离出所测脑区,经处理后用HPLC检测其兴奋性神经递质含量,并采用SPSS软件对定量分析结果进行统计学分析.结果:1.对于兴奋性神经递质Asp、Glu、Gly和Leu,分析方法在0.1-200μg/mL的浓度范围内线性关系良好,相关系数γ>0.9998.对Asp、Glu、Gly和Leu最低检测限分别为40.5ng/mL、4ng/mL、47.6ng/mL和8.4ng/mL,回收率>93.7%,日内精密度RSD<3%,日间精密度RSD<10%.2.在前额叶皮质中,与空白组比较时,Asp、Glu和Leu的含量在给于氯胺酮注射后开始降低,Asp在5d降到最低值,在3d~15d组有显著性差异(p<0.05);Glu在13d降到最低值,在3d~15d组中有显著性差异(p<0.01);Leu在7d降到最低值,在3d,5d,7d和11d中有显著性差异(p<0.05);Gly的含量在给于氯胺酮注射后既有降低也有升高,Gly在5d时降到最低值,在9d上升到最高值,在3d~13d组有显著性差异(p<0.05).与生理盐水组比较时发现,Asp、Glu和Leu的含量在给于氯胺酮注射后既有升高也有降低,Asp和Glu在3d时升高到最高值,Asp在3d~15d组有显著性差异(p<0.05),Glu在3d~15d组有显著性差异(p<0.01);Leu在13d升到最高值,并且13d和15d的含量变化基本稳定,Leu在5d、7d、9d、13d和15d组有显著性差异(p<0.05);Gly的含量在给于氯胺酮注射后开始上升,在9d上升到最高值,Gly在3d-15d组有显著性差异(p<0.05).3.在海马中,与空白组比较时,Asp和Glu的含量在给于氯胺酮注射后开始降低,Asp在5d降到最低值,在3d~15d组中有显著性差异(p<0.05);Glu在15d降到最低值,在3d~13d组有显著性差异(p<0.01);Gly在5d时降到最低值,在13d上升到最高值,在5d~15d组有显著性差异(p<0.05);Leu在7d降到最低值,13d升到最高值,并且13d和15d的含量变化基本稳定,Leu在3d、5d、7d、11d和15d组有显著性差异(p<0.05).与生理盐水组比较时发现,Asp、Glu、Gly和Leu的含量在给于氯胺酮注射后既有升高也有降低,Asp和Glu在3d升高到最高值,Asp在3d~13d组有显著性差异(p<0.01),Glu在3d,7~15d组有显著性差异(p<0.05);Gly在13d升高到最高值,在3d~13d组都有显著性差异(p<0.01);Leu在13d升到最高值,在3d、7d、9d、13d、15d组都有显著性差异(p<0.01).4.在杏仁体中,与空白组比较时,Asp和Glu的含量在给于氯胺酮注射后开始降低,Asp在5d降到最低值,在3d~13d组都有显著性差异(p<0.01);Glu在13d降到最低值,在3d~15d组都有显著性差异(p<0.01);Gly和Leu的含量在给于氯胺酮后既有升高也有降低,Gly在13d升到最高值,5d时降到最低值,Gly在3d-15d组都有显著性差异(p<0.05);Leu在13d上升到最高值,在7d降到最低值,在3d、5d、7d、11d和13d组有显著性差异(p<0.01).与生理盐水组比较时发现,Asp和Glu的含量在给于氯胺酮注射后开始降低,Asp在5d降到最低值,在3d、5d、7d、11d和13d组有显著性差异(p<0.05);Glu在13d降到最低值,在3d-15d组有显著性差异(p<0.01);Gly的含量在给于氯胺酮后既有升高也有降低,Gly在13d时升到最高值,在3d-7d,1ld-15d组有显著性差异(p<0.05);Leu的含量在给于氯胺酮注射后开始升高,在13d升高到最高值,在3d-15d组有显著性差异(p<0.05).5.在乳头体中,与空白组比较时,Asp、Glu和Leu的含量在给于氯胺酮注射后开始降低,Asp和Leu在11d降到最低值,Glu在13d降到最低值,Asp和Glu在3d-15d组有显著性差异(p<0.01);Leu在3d-11d组都有显著性差异(p<0.01);Gly的含量在给于氯胺酮后既有升高也有降低,Gly在9d升到最高值,11d时降到最低值,在3d、7d、9d、11d和15d组有显著性差异(p<0.05).与生理盐水组比较时发现,Asp、Glu和Leu的含量在给于氯胺酮注射后既有升高也有降低,Asp和Glu在3d升到最高值,Asp在5d和1ld组有显著性差异(p<0.05),Glu在3d-15d组有显著性差异(p<0.01);Leu在15d升高到最高值,在5d,9d-15d组有显著性差异(p<0.05);Gly的含量在给于氯胺酮后升高,在9d升到最高值,在5d、7d、9d、13d和15d组有显著性差异(p<0.05).结论:1.建立了高灵敏度、高选择性、高回收率、简便快捷的的大鼠相关脑区中Glu、Asp、Gly和Leu定量分析方法.2.氯胺酮对大鼠前额叶皮质、海马、杏仁体和乳头体中Asp、Glu、Gly和Leu含量有不同程度的影响,其中Asp、Glu和Leu在所测脑区中含量变化最明显.相对于空白组,Asp和Glu含量呈现降低趋势,Gly含量总体变化不是很大,既有升高也有降低,Leu在所测脑区中的含量都比较少,含量既有升高也有降低.导致这一变化的原因,可能是氯胺酮作用于NMDA受体引起的.