凋亡素原核表达载体构建、表达、纯化及鉴定的实验研究
Prokaryotic Expression Vector Construction and Expression, Purification and Identification of Apoptin
目的:构建改良型TAT-VP3融合基因的原核表达载体,表达目的蛋白.成功表达后,对其进行纯化,并对纯化的目的蛋白进行鉴定,切除GST标签,得到凋亡素蛋白.方法:采用PCR法设计和扩增改良型TAT-VP3融合基因,克隆至表达载体,构建改良型TAT-VP3融合基因的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,15%SDS-PAGE鉴定.利用IPTG温控诱导改良型TAT-VP3融合蛋白表达后,表达蛋白经GST亲和层析纯化,蛋白纯化产物进行SDS-PAGE和Western bolt鉴定,并利用Prescission蛋白酶将GST标签从纯化的融合蛋白上切除.结果:成功构建了改良型TAT-VP3融合基因的原核表达载体,经酶切、测序鉴定,证明载体构建正确.改良型TAT-VP3融合蛋白经温控诱导后得到稳定表达,经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量42000的特异性目的条带,经GST亲和层析纯化后,得到了纯度较高的改良型TAT-VP3融合蛋白.Western bolt验证了表达蛋白的特异性.利用Prescission蛋白酶将纯化的融合蛋白进行GST标签切除,得到了凋亡素蛋白.结论:成功构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,表达目的蛋白.并纯化出改良型TAT-VP3融合蛋白,将GST标签切除后,最终得到了凋亡素蛋白,为进一步研究其免疫原性和抗肿瘤活性奠定了基础.
- 作者：
- 张启波
- 学位授予单位：
- 昆明医学院
- 专业名称：
- 外科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2011年
- 导师姓名：
- 王剑松；徐鸿毅；石永福；杨德林；左毅刚
- 中图分类号：
- Q78
- 关键词：
- 凋亡素；改良型TAT-VP3融合基因；改良型TAT-VP3融合蛋白；载体构建；表达；纯化；鉴定
- Apoptin；Improved TAT-VP3 Fusion protein；Vector Construction；Expression；Purification；Identification