RNA干扰对PANC-1胰腺癌细胞hTERT基因表达的影响
目的:构建两条能表达针对hTERT的siRNA的重组质粒hTERT-S370和hTERT-S371.方法:搜索Genbank中的hTERT基因序列,筛选出最优的干扰靶位点,并在GenBank中进行BLAST分析,选取序列;根据靶位点和pSilence4.1-CMV neo表达载体的特点,设计、合成表达模板;将表达模板连接到载体上,构建hTERT-siRNA表达载体;重组质粒进行酶切、测序鉴定.结果:合成的S370和S371两对寡核苷酸单链退火形成双链,2%琼脂糖凝胶进行电泳,结果显示两片段均为55bp,琼脂糖凝胶电泳图显示清晰条带.重组质粒经HindⅢ及BamHI双酶切后,琼脂糖凝胶电泳示:重组质粒在电泳图上于预期位置出现阳性条带与实验预想一致,初步鉴定正确.测序结果表明siRNA表达模板成功构建于pSilence4.1-CMV neo载体上,序列完全正确.结论:以hTERT基因为靶点的siRNA序列设计合理,成功获得两条均为55bp的hTERT-S370和hTERT-S371.经酶切和测序鉴定证实hTERT-S370和hTERT-S371表达模板分别成功构建于pSilence4.1CMV neo载体上,获得两条重组质粒plasmids Silencer 4.1-CMV neo-hTERT-S370和Silencer 4.1-CMV neo-hTERT-S371,序列完全正确.目的:用重组质粒pSilencer4.1CMV neo- hTERT-siRNA转染PANC-1胰腺癌细胞,初步观察其在体外细胞水平上的抗胰腺癌作用.方法:通过脂质体2000将pSilencer4.1-CMVneo-hTERT-siRNA转染PANC-1细胞,并通过G418进行阳性细胞筛选;筛选2周后,通过稀释法挑细胞克隆;对单克隆化的细胞进行hTERT基因表达的RT-PCR检测;结果:RT-PCR结果显示:S370-A1组、S371组、S370/371-D4组、S370/371-B5组、S371AC组、S371AC-E5组、S371AC-A2组、S371AC-C1组、S371AC-C2组PANC-1细胞中hTERT-mRNA的表达较NC阴性对照组和细胞组PANC-1细胞中hTERT-mRNA表达量显著下降.同时内参照GAPDH,各组间无明显差别结论:重组质粒pSilencer4.1 CMVneo-hTERT-siRNA能特异性的诱导同源互补的mRNA降解,下调hTERT mRNA表达,具有良好的RNAi沉默效应.
- 作者：
- 周小虎
- 学位授予单位：
- 昆明医学院
- 专业名称：
- 外科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2011年
- 导师姓名：
- 谭晶；孙敏；莫小华
- 中图分类号：
- R735.9
- 关键词：
- 重组质粒；hTERT；pSilencer；RNAi；PANC-1
- recombinant plasmid；hTERT；pSilencer；RNAi；PANC-1