大鼠骨髓间充质干细胞体外分化为肝细胞的致瘤性研究及其基因表达谱变化
The Tumorigenic and Its Gene Expression Changes of Differential Hepatocytes from Rat Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

骨髓来源的间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是骨髓内具有多种分化潜能的一类干细胞亚群,在一定条件下可以分化为多种不同的组织细胞.近来研究显示,MSCs在干细胞因子(SCF)、肝细胞生长因子(HGF)和成纤维生长因子-4(FGF-4)以及肝细胞提取液的诱导下能分化为肝细胞.本研究旨在探讨MSCs诱导分化为肝细胞过程中的最佳诱导条件,分化后肝细胞的功能特点及其安全性,并初步分析诱导分化过程中细胞基因表达谱的变化,揭示其分化的分子机制,为临床应用MSCs治疗肝脏疾病提供实验依据.[目的]1.比较目前常用的诱导因素诱导MSCs分化为肝细胞的效果,以探讨大鼠骨髓MSCs向肝细胞方向分化的最佳诱导条件.2.运用病理学技术及分子生物学技术检测分化后细胞的功能特性,全面鉴定分化后细胞是否为肝细胞.3.将分化后肝细胞以及MSCs注射至裸鼠皮下,确定是否有肿瘤形成,为临床应用MSCs作为肝脏再生医学的种子细胞的安全性提供实验依据.4.应用基因芯片检测正常肝细胞与MSCs以及正常肝细胞与分化后细胞之间的基因表达谱差异,进一步了解大鼠骨髓MSCs向肝细胞方向分化的分子机制.[方法]1.无菌条件下取成年大鼠四肢骨骨髓,采用直接贴壁筛选法和密度梯度离心法培养细胞,对原代、第三代和第六代MSCs进行流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD34、CD90的表达.2.在培养液中分别添加不同量的SCF、HGF、FGF-4和不同组合的细胞因子以及不同量的肝细胞提取液,诱导MSCs向肝细胞方向分化,以未加任何诱导因素的培养液作为对照组,观察诱导细胞的形态学变化.3.应用生化检测诱导培养液上清中白蛋白和尿素的产生量,免疫组化检测分化后细胞的细胞角蛋白-18(CK18)的表达,并观察分化后细胞的吲哚靛青绿(ICG)的摄入情况.4.将培养液中添加单一细胞因子SCF、HGF和FGF-4和三种细胞因子以及肝细胞提取液诱导分化的肝细胞以及MSCs注射至裸鼠皮下,为期2个月观察肿瘤形成情况.5.运用基因芯片技术检测MSCs与正常肝细胞以及分化后肝细胞与正常肝细胞之间的基因表达谱差异,筛选骨髓MSCs向肝细胞方向分化的有关基因,从分子水平揭示MSCs向肝细胞方向分化的分子机制.[结果]1.分离培养的MSCs生长良好,细胞形态为长梭形,排列呈旋涡状.直接贴壁培养的MSCs较密度梯度离心培养的MSCs生长速度快,但密度梯度离心培养的MSCs相对更纯.流式细胞仪检测显示原代、第3代和第6代MSCs均表达CD29、CD90,而不表达CD34.2.诱导分化后的细胞呈圆形或多角形,类似肝细胞形态.未加任何诱导因素的培养细胞仍旧呈长梭形.不同用量的单一SCF、HGF和FGF-4、不同组合的细胞因子以及不同用量的肝细胞提取液均能诱导MSCs向肝细胞方向分化,但肝细胞提取液(1.0mg/ml)组的诱导效果最佳.3.各诱导培养上清液中均有不同量的白蛋白和尿素的产生,诱导分化后细胞均见不同程度CK18的表达,并见分化后细胞不同程度的摄入ICG.未加任何诱导因素的细胞培养上清液中未见白蛋白和尿素产生,细胞不表达CK18,同时不能摄入ICG.4.在为期2个月的裸鼠致瘤实验中,各实验组裸鼠的局部注射皮肤组织、肝组织和肺组织肉眼观均无肿块形成,显微镜下均未见组织结构和细胞形态异常.5.基因芯片结果显示大鼠正常肝细胞与MSCs之间存在49个显著性差异的GO类基因表达,而大鼠正常肝细胞与分化后肝细胞之间仅存在15个有关细胞发育及生物学调节GO类基因有显著性差异.[结论]1.贴壁培养筛选法和密度梯度离心法均能从大鼠骨髓中分离培养得到MSCs,密度梯度离心培养法培养的MSCs更纯.大鼠骨髓MSCs强表达CD29、CD90,而不表达CD34.2.细胞因子(SCF、HGF、FGF-4)和肝细胞提取液均能诱导MSCs向肝细胞方向分化,其中肝细胞提取液的诱导效果最佳.3.检测诱导培养上清液中白蛋白和尿素的产量、分化后细胞CK18的表达以及ICG摄入情况,可以全面鉴定MSCs分化后肝细胞的功能特点.4.目前常用的细胞因子(SCF、HGF、FGF-4)和肝细胞提取液诱导MSCs分化后的肝细胞在裸鼠体内无肿瘤形成.5.在基因水平上,大鼠正常肝细胞与骨髓MSCs之间存在显著的基因表达差异,而与经肝细胞提取液诱导MSCs分化后的肝细胞之间无明显基因表达的差异,分化后肝细胞的功能、代谢、酶活性及其调节作用接近正常肝细胞.