转录因子KLF2、KLF4预测诊断深静脉血栓的实验研究
The Study of Transcription Factor KLF2 and KLF4 for Predictive Diagnosis Deep Vein Thrombosis
目的研究转录因子KLF2及KLF4在大鼠创伤性深静脉血栓模型中,血栓形成前、形成、不形成状态所采集相应血管组织、血液样本中mRNA的表达变化,作为预测诊断深静脉血栓分子标志物的可行性,以及在血栓形成中的转录调控作用,为深入研究深静脉血栓的分子机制、调控网络奠定基础.材料和方法1、基因芯片数据归纳分析①参见王兵博士论文《大鼠急性创伤性深静脉血栓模型建立及股静脉基因表达研究》中实验动物分组、实验步骤、Affytrix Rat230A基因表达谱芯片检测;②对基因芯片数据整理归纳,应用倍数变化方法进行分析,筛选与深静脉血栓形成密切相关的差异表达基因;③分析KLF2及KLF4在大鼠深静脉血栓形成过程血管组织中的表达变化趋势;④在NCBI网站GENE中查询KLF2及KLF4在大鼠和人类中的基因序列,将两者的基因序列代入BLAST中进行比对,明确与人类基因的同源性.2、大鼠血液Real Time PCR检测①建立大鼠急性创伤性深静脉血栓形成模型;根据观察时间和血栓形成情况,将100只SD大鼠分为正常对照(A组)、血栓形成前(B组)、血栓形成高峰期(C组)、无血栓形成(D组)四组;②在相应的时相点,采用心脏取血的方法抽取每只大鼠2.0ml血液标本,切取双侧股静脉;③采用Trizol法提取血液总RNA,经3%琼脂糖凝胶电泳及分光光度计法检测评估各组总RNA质量;④应用Oligo 6.69设计KLF2及KLF4 RT-PCR反转录引物,以GAPDH为内参照,将各组大鼠血细胞RNA反转为cDNA,PCR反应扩增(预变性、变性、退火、延伸、终末延伸),对PCR产物进行实时荧光定量(Real Time PCR)检测,通过溶解曲线分析识别特异性扩增产物,通过扩增曲线检测产物量的变化.⑤采用2~(-ΔΔCT)算法处理Real Time PCR数据,描述KLF2及KLF4在B、C、D组与A组基因表达量的比值,分析二者在大鼠深静脉血栓形成过程血液中的表达变化趋势;⑥应用统计分析软件SPSS 11.5进行统计分析,P<0.05为具有显著统计学差异.结果1、大鼠创伤性深静脉模型股静脉Affymetrix基因芯片数据中,KLF2、KLF4具有自创伤即刻组(B组)开始,到血栓形成高峰组(D组)逐渐下调表达的共同趋势(KLF2-BvsA:-0.104,CvsA:-0.715,DvsA:-1.565;KLF4-BvsA:-0.054,CvsA:-0.834,DvsA:-1.276).其中血栓形成高峰组较正常对照组(A组)出现显著差异下调表达.无血栓形成组(G组)较正常对照组表达水平略有升高(KLF2-GvsA:0.135;KLF4-GvsA:0.245).2、大鼠KLF2及KLF4基因与人类基因的BLAST同源性比对结果分别为90.4%与94.2%;3、本研究大鼠创伤性深静脉模型至造模后25h,血栓形成率63.39%(42/66),与基因芯片检测大鼠模型同时刻血栓形成率(68.11%,126/185)无显著性差异(P=0.405>0.05);至造模后72h,血栓不形成率25.76%(17/66),与基因芯片检测大鼠模型血栓不形成率(19.46%,36/185)无显著性差异(P=0.282>0.05).4、KLF2和KLF4在大鼠创伤性深静脉模型血液Real Time PCR检测与血管组织基因芯片检测中表达变化趋势一致(Z=-1.363,P=0.173>0.05).血栓形成前组(B组)、血栓形成高峰组(C组)较正常对照组(A组)出现均显著差异下调表达(KLF2-BvsA:-1.510,CvsA:-2.889;KLF4-BvsA:-1.262,CvsA:-2.041),而无血栓形成组(D组)较正常对照组出现上调表达(KLF2-DvsA:0.796;KLF4-DvsA:0.612).结论1、KLF2、KLF4在大鼠深静脉血栓形成过程血液中的表达变化与血管组织中一致,可作为深静脉血栓预测诊断候选分子标志物;2、KLF2、KLF4在深静脉血栓调控网络中具有重要的转录调控作用,是血管内皮细胞稳态调节的关键因素及信号转导途径中重要的调控因子,通过促进抗凝因子表达、抑制血管炎症等作用抑制血栓形成;3、KLF2、KLF4可能是调节血管功能和血栓性疾病的重要"分子开关",有望成为临床深静脉血栓预测诊断分子标志物.
- 作者：
- 代耀军
- 学位授予单位：
- 昆明医学院
- 专业名称：
- 骨外科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2010年
- 导师姓名：
- 赵学凌；王兵
- 中图分类号：
- R543
- 关键词：
- KLF2；KLF4；深静脉血栓；预测诊断；分子标志物
- Krüppel-like transcription factor 2；Krüppel-like transcription factor 4；Deep venous thrombosis；Predictive diagnosis；Molecular markers
- 基金项目：
- 国家自然科学%云南省应用基础研究