绵羊类胚胎干细胞克隆及特性分析
Cloning and Characterization of Ovine Embryonic Stem-like Cells
胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胎儿的原始生殖细胞,具有全能分化和无限增殖的潜力.在适当条件下,胚胎干细胞可被诱导分化为各种细胞组织,这一特性使其在基础研究、移植治疗和基因治疗中具有诱人的应用前景.本研究从绵羊体外受精获得桑椹胚,用13.5日龄的小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层,分离培养绵羊类胚胎干细胞.目的在于探讨绵羊胚胎干细胞系的建立方法.通过研究,我们获得了如下结果.1、通过对13.5天小鼠的胎儿进行胚胎成纤维细胞的分离培养,成功地建立了小鼠胎儿成纤维细胞饲养层(MEF)的制作方法,所制作的饲养层细胞形态正常,具有良好的生存能力.2、在所建立的MEF饲养层上,以绵羊早期胚胎为材料,分离克隆到鸟巢状绵羊类ES细胞集落.绵羊类ES细胞AKP染色为阳性,表明绵羊类ES细胞表面存在AKP的表达.3、从屠宰场获得卵巢,用剖切法可以显著提高卵母细胞的利用率,获得的A,B级卵母细胞数显著高于抽吸法(p<0.05),而抽吸法获得的C级卵母细胞数显著高于剖切法(p<0.05).剖切法获得的卵母细胞体外成熟率显著高于抽吸法(p<0.05);而卵母细胞成熟后体外受精率两种采卵方法没有显著差异(p>0.05),所以剖切法是获得绵羊卵母细胞的理想方法.4、培养液中添加胎牛血清(FCS)显著提高卵母细胞体外成熟率.体积比为10%和15%的胎牛血清(FCS)对卵母细胞的成熟率差异不显著.5、促黄体素(LH)和表皮生长因子(EGF)能显著提高卵母细胞体外成熟率,表皮生长因子(EGF)能使卵丘扩散良好.6、四小时内卵巢运输温度在10~15℃、20~25℃、30~35℃第一极体排出率为45.45%、64.86%、70.97%,囊胚率为21.81%、34.58%、29.63%,运输温度越高卵母细胞的成熟度也越高,但到囊胚时较高的温度却不能获得较高的囊胚率.绵羊卵母细胞完全体外化培养的长距离运输适宜温度为20~25℃.7、16~18h、20~22h、24~26h和28~30h四种不同时间对卵母细胞进行成熟培养.在16~18h受精的成熟率和囊胚率都最低;在20~22h受精,不仅成熟效果好,而且囊胚率也最高,在24h后受精,成熟率都非常高,但囊胚率下降.所以适宜的体外成熟时间为20~22h.
- 作者：
- 王建锋
- 学位授予单位：
- 甘肃农业大学
- 专业名称：
- 临床兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2007年
- 导师姓名：
- 赵兴绪；张勇
- 中图分类号：
- Q813
- 关键词：
- 绵羊；卵母细胞；体外成熟；体外受精；类胚胎干细胞；小鼠胎儿成纤维细胞
- Ewe；Ovine；In vitro maturation；In vitro fertilization；Embryo stem-like cell；Mouse embryo fibroblast