密码子优化的O型口蹄疫病毒VPI基因转化饲草玉米的高效表达载体构建
Construction of the High Efficient Maize Expression Vector with Codons Optimized VPI Gene of the Foot-and-Mouth Disease Virus Type O
口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的偶蹄动物传染病,严重危害家畜的生产力和畜产品质量,给畜牧业和进出口贸易造成巨大的经济损失,直接威胁着国际贸易和人类食品卫生,因而受到人们的普遍关注.疫苗为有效预防口蹄疫提供了重要技术手段,但由于FMDV的血清型和变异株多,用于防控FMD的灭活疫苗生产过程中还存在散毒和病毒灭活不完全等潜在危险.鉴于口蹄疫传统疫苗的安全隐患及根除口蹄疫的需要,研制高效、安全、使用方便的转基因植物可饲化疫苗成为当前科学家防控FMD研究的热点.本研究根据玉米编码蛋白使用密码子的偏好性,构建了含密码子优化的O型口蹄疫病毒VP1基因植物双元表达载体.为FMD转基因玉米可饲化疫苗的研究提供试验基础.该试验研究内容如下:1.含有密码子优化的O型口蹄疫VP1基因片段的获得:根据Genbank上公布的O/China/99病毒VP1基因序列,并按照玉米基因组优势密码子的使用原则,对野生型VP1基因密码子进行了改造;在VP1基因上游引入Kozak序列、linker和霍乱狐菌毒素B亚单位(CT-B)基因序列;同时在基因序列的3′端加上一段内质网引导肽SEKDEL;最后在设计基因序列HW055(CTB-linker-VP1/O)的5'端和3'端分别引入XmaI和ClaI的酶切位点.设计好的整个序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,获得了含优化密码子VP1的基因序列HW055.以上合成序列与puc克隆载体连接形成重组质粒puc-HW055;送大连宝生物工程技术服务有限公司进行测序鉴定.证明合成序列HW055与按要求设计的序列完全一致.2.植物双元表达载体的构建:对重组质粒puc-HW055和表达质粒pC1300SOD3.1用XmaI/ClaI进行双酶切.纯化回收的酶切产物HW055和pC1300SOD3.1载体连接,构成植物中间表达载体pC1300-HW055.将鉴定的阳性重组质粒pC1300-HW055接种于含Kan液体培养基中,提取质粒(Mini-Ti).以提取的重组质粒为模板,利用合成的特异引物对目的基因HW055进行PCR扩增和对重组质粒做双酶切(XmaI/ClaI)进行鉴定.中间表达载体构建成功后,采用三亲杂交法将植物中间表达载体pC1300-HW055从大肠杆菌DH5a导入根癌农杆菌GV3101.通过Ti质粒共同组成双元表达载体系统.抗性筛选、农杆菌提取质粒的PCR鉴定,证明表达载体构建成功,该表达载体与农杆菌中辅助
- 作者：
- 蔺晓忠
- 学位授予单位：
- 甘肃农业大学
- 专业名称：
- 临床兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2007年
- 导师姓名：
- 余四九；张永光；潘丽
- 中图分类号：
- S852.5
- 关键词：
- FMDV；VP1基因；密码子优化；植物表达载体
- FMDV；VP1 gene；codons usage optimization；plant expression vector