猪瘟病毒结构蛋白与生物学特性的关系
猪瘟(Classic Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classic Swine Fever virus,CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染疾病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizoofies,OIE)列为必须通报传染病之一。猪瘟石门株是我国分离较早的标准强毒株,不引起兔体发热；猪瘟兔化弱毒(HogCholera Lapinized Virus,HCLV)疫苗是我国具有自主知识产权的疫苗株(国际上称为C株),它在细胞上生长能力差,能引起兔体发热；猪瘟T株是法国的一株低温诱变弱毒株,它在细胞上生长良好,不引起兔体发热。本研究运用反向遗传操作技术,以本实验室构建的T株感染性克隆为基础,构建两株嵌合病毒质粒pCT和pSMT,并成功拯救得到两株嵌合病毒vCT和vSMT,通过它们在细胞上的生长特性和兔体热反应特性探讨猪瘟病毒结构蛋白与细胞生长特性以及兔热反应之间的关系。
为研究猪瘟兔化弱毒株、猪瘟病毒石门株和T株结构蛋白与生物学特性的关系,本研究构建了两株嵌合病毒。通过比较NCBI国内外已公布的猪瘟病毒C株、石门毒株和本实验室拯救的猪瘟病毒T株的全基因序列,在结构蛋白序列中设计并合成了三对共用引物,通过RT-PCR分别扩增并获得了兔化弱毒株和猪瘟石门株的全长结构蛋白序列。在CSFV T株全长感染性克隆的基础上,将CSFV T株结构蛋白基因分别用猪瘟弱毒疫苗株C株的结构蛋白基因和猪瘟石门强毒株的结构蛋白基因替换,构建两个嵌合感染性克隆质粒pCT和pSMT,经多组酶双酶切鉴定,确定嵌合成功。经BHK-21细胞电转、SK6细胞电转等方法,成功拯救出了两株嵌合病毒vCT和vSMT,摸索出了SK6细胞电转拯救病毒的试验条件。通过常规病毒传代和带毒细胞传毒两种方法对嵌合病毒进行病毒传代,猪瘟病毒抗原检测ELISA以及传代病毒的PFU滴度测定,探索病毒增殖的最佳条件,结果表明带毒细胞传代病毒滴度高于常规病毒传代病毒滴度,每代传代病毒的PFU和ELISA检测结果基本一致。用免疫组化染色、RT-PCR、测序三种方法确认传代病毒vCT、vSMT没有发生突变和变异。通过比较vCT、vSMT、vT在细胞上的生长特性,揭示了兔化弱毒株及猪瘟石门株结构蛋白能在一定程度上决定CSFV在细胞上的生长特性。
为研究猪瘟病毒结构蛋白与兔热反应之间的关系,试验兔被分为五组。第一组,2只兔,每只静脉注射50RID的C株兔组织毒；第二组,2只兔,每只静脉注射2ml正常细胞上清液；第三组,5只兔,每只静脉注射107pFU T株毒；第四组,3只兔,每只静脉注射1.8×103 PFU vCTF0;第五组,3只兔,每只静脉注射103 PFU vCTF1。体温检测结果显示,vCT与对照C兔热毒能引起兔热反应,而vT不能引起兔热反应。由此可知,CSFV C株结构蛋白与兔热反应关系密切。
为研究嵌合病毒vCT在兔子体内的繁殖特性,采集兔体血清样本、脾、淋巴结等器官,用4％多聚甲醛固定,石蜡包埋,HE和免疫组化染色,观察样品的临床症状及病理剖检变化、组织病理学变化、检测特异性病毒、抗体等,结果表明脾脏出血,且红细胞变形,红髓局部可见颗粒细胞,白髓面积明显的缩小,淋巴细胞增多,淋巴结被大量大淋巴细胞浸润,阳性物质基本分布在淋巴结的髓质和脾脏的红髓部位,阳性细胞主要包括网状细胞、部分大淋巴细胞等。这表明嵌合病毒vCT在兔体内繁殖,引起了组织损伤和机体的免疫应答。
综合以上结果表明,猪瘟兔化弱毒株、猪瘟石门强毒株结构蛋白决定猪瘟病毒在细胞上的生长特性,猪瘟兔化弱毒株结构蛋白与兔热反应有关,猪瘟兔化弱毒株嵌合病毒在兔体内能够繁殖。这些为进一步提高猪瘟兔化弱毒株疫苗细胞培养能力,改进猪瘟兔化株疫苗生产工艺、研究开发理想的DIVA疫苗奠定一定的基础。
- 作者：
- 朱元源
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2010年
- 导师姓名：
- 赵启祖
- 中图分类号：
- S852.651
- 关键词：
- 猪瘟病毒；嵌合病毒；细胞生长特性；兔热反应
- Classical swine fever virus；chimeric viruses；rabbit fever；growth characteristics
- 基金项目：
- 国家自然科学