三疣梭子蟹微卫星文库的构建及多态性位点筛选
三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是一种重要的渔业资源，广泛分布于我国沿海。从1981年起，三疣梭子蟹被列为我国海洋水产养殖品种之一，以其经济效益可观，食用营养价值高，生长繁殖快速等优点，成为水产养殖业的主要品种之一。近年来，由于各方面原因，三疣梭子蟹的资源量急剧下降，对病害和环境胁迫的防御能力下降，自然种质资源严重退化。为了恢复和提高亲本蟹及蟹种的质量，保持养殖业的健康发展，同时为了避免野生种质资源的衰竭，实现该自然资源的可持续利用，对三疣梭子蟹进行遗传种质资源研究已迫在眉睫。而开发一套合理有效的分子遗传标记，是开展该物种遗传种质资源保护研究的必要前提。
本研究以舟山群岛沿海的野生成体三疣梭子蟹为样本，采用磁珠富集法构建微卫星DNA文库。经Sau3AI酶切后的200～1000bpDNA纯化片段，与两端已知序列的人工接头连接，用含有生物素标记的(CA)12，(GA)12和(TGC)8探针杂交，根据磁珠的链酶亲和素与生物素特异结合的特性，捕获含微卫星序列的单链DNA，以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增，TA克隆后，再筛选阳性克隆，构建好富集文库。测序其中的60个阳性克隆，得到42条微卫星序列，其中完美型的占73.8％，非完美型的占21.4％，混合型的占4.8％，微卫星重复次数主要集中在10～30次之间。
利用Premier Primer5.0软件，我们设计出31对三疣梭子蟹微卫星引物，其中16对能够稳定扩增出特异性目的片段。用这16对微卫星引物对舟山群岛的38个野生三疣梭子蟹进行PCR扩增、8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染，最后成功检测到11个具有多态性的微卫星位点。
用群体遗传学软件POPGENE32统计了这11个微卫星位点在舟山群岛、厦门沿海两个群体的遗传多样性，分析了两群体的等位基因频率、观测等位基因数、有效等位基因数、基因观测杂合度(Ho)、基因期望杂合度(He)和哈温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)。结果显示：11个微卫星位点在舟山群岛、厦门沿海两群体中的平均有效等位基因数分别为12.6(8.57～17.61)、12.9(7.17～17.89)，平均观察杂合度分别为0.84(0.58～0.97)、0.82(0.68～0.93)，平均期望杂合度分别为0.92(0.88～0.94)、0.92(0.86～0.94)，平均多态信息含量分别为0.91(0.88～0.94)、0.92(0.85～0.94)。哈代-温伯格平衡检验结果表明，所有位点均处于平衡状态。这些结果显示：三疣梭子蟹种群遗传多样性水平高，具有较高的选择潜力。由于仅有两个地点的采样，两种群之间没有检测出遗传分化现象。在今后的实验中，需要增加采样地点与样本数，以期获得种群遗传分化更可靠的实验结果。
利用这套微卫星位点，我们在红星梭子蟹(P. sanguinolentus)和远海梭子蟹(P.pelagicus)两个物种中进行跨物种扩增检测。其中，3个微卫星位点在远海梭子蟹中呈现多态性，2个位点在红星梭子蟹呈现多态性。
所有结果表明：本研究筛选出来的11个微卫星DNA位点可以为三疣梭子蟹种质资源保护与遗传多样性研究提供一套有用的分子标记，为合理保护利用这一资源，以及后续的遗传改良与优良品系的选育打下了基础。
- 作者：
- 刘汝
- 学位授予单位：
- 上海海洋大学
- 专业名称：
- 渔业资源
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2010年
- 导师姓名：
- 许强华
- 中图分类号：
- S968.252；S917