西伯利亚鲟的侧线神经丘发育形态学观察及其相关基因Sox9,Sox2表达检测

西伯利业鲟(Acipenser baerii)隶属鲟形目（Acipenser iformes)，鲟科（Acipenser idae)，鲟属（Acipense)，为软骨硬鳞鱼，分布于西伯利亚河流和湖泊，是地球上最为古老的物种和鱼类之一，因而具极高的进化研究价值。以往西伯利亚鲟的研究主要集中于育种，繁殖和生理生化水平。近年来，西伯利亚鲟胚胎及侧线神经发育分化被学者所关注。同大多数鱼类一样，西伯利亚鲟侧线神经的神经丘位于其侧线管内，每一个神经丘聚集成百个神经细胞，包含有周围和中枢神经通路，有感觉水流、水压、水温、听觉等机能。为了追踪西伯利亚鲟侧线神经发育过程及其作用的相关基因，本文对此开展了初步研究，取得了以下结果：
　　 1、形态学研究方面：
　　 为揭示西伯利亚鲟侧线管内侧线神经丘形态结构及胚后侧线神经丘发育过程，本研究对西伯利亚鲟(Acipenser baerii)成鱼进行石蜡切片并进行HE染色，同时利用荧光染料DiA[4-(4-Diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide]对侧线管内侧线神经丘毛细胞特异性标记的特点，示踪了西伯利亚鲟胚后仔鱼各时期侧线神经丘发育分化发育的过程。侧线神经丘组织学石蜡切片结果显示：西伯利业鲟侧线管内侧线神经丘毛细胞如纤毛状，呈竖立紧密排列。侧线神经丘发育荧光示踪结果表明：出膜3天仔鱼眼眶后神经基板发育分化的活动剧烈，出膜10天的仔鱼眼眶后方的神经基板分化出眼眶上下侧线神经丘的两个分支，同时眼眶后神经基板进一步向后分化发育在眼眶后部形成躯干侧线神经丘，但整个侧线神经丘还未完全发育完成，待出膜15天时，眼眶上下和躯干侧线神经丘已基本发育完全，出膜22天的仔鱼侧线神经丘发育基本完成。
　　 2、分子生物学研究方面：
　　 a)为提高绘制西伯利亚鲟侧线神经丘发育相关基因Sox9和Sox2时空表达谱的可信度和精确度，根据已发表的鱼类β-actin基因cDNA同源保守区，设计引物，进而结合RACE技术克隆了西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长，序列分析表明西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长1322bp，其包括的137bp的5'端非翻译区，57bp的3端非翻译区和编码375个氨基酸残基的1125bp开放阅读框。与其他物种进行分子进化分析表明，该基因具有极高的保守性，且与斑马鱼，黄颡鱼的亲缘关系较近。
　　 b)为揭示西伯利亚鲟Sox9基因在其侧线神经丘发育分化过程中的作用，根据已发表的鱼类Sox9基因的HMG-box保守区的序列设计引物，结合同源克隆和RACE方法获得了西伯利亚鲟Sox9基因cDNA全长序列，经序列分析表明，所克隆Sox9 cDNA全长1409bp，包括开放阅读框(ORF)1082bp，5'UTR(非编码区)为20bp和3'UTR为307bp。1083bp ORF共编码360个氨基酸，相对分子质量为41221.7U.序列分析表明，其与施氏鲟的亲缘关系较近，其次是斑马鱼。借助β-actin作为内参基因，经实时荧光定量技术对西伯利亚鲟Sox9在各组织以及在胚胎发育各时期当中的相对表达量检测发现，该基因的表达具有明显的组织差异性和时间差异性。其中，胰脏和肌肉组织中表达量相对较低，而肾，脑，肝中的表达量相对较高且差别不大，是胰脏和肌肉表达量的2.3倍和21倍。在胚胎发育的不同阶段Sox9的表达量也有一定变化，在囊胚期、神经胚期及心脏形成期，Sox9表达量相对较高，特别是囊胚期和神经胚期，其表达量是原肠期的1.8倍和1.6倍。
　　 c）为深入探究西伯利亚鲟Sox2基因在其侧线神经丘毛细胞分化再生过程中的作用，借助已发表的鱼类Sox基因的HMG-box保守区的序列设计引物，结合同源克隆技术获得了西伯利亚鲟Sox2基因的同源保守区，得到一个长度为768bp的序列，该序列也具较高的保守性，经分子进化分析发现该基因与其他物种的相似性也达到了70％以上。随后，借助β-actin作为内参基因，对Sox2基因在西伯利亚鲟成鱼各组织及胚胎发育各时期进行实时荧光定量PCR检测，发现Sox2基因在不同的组织当中均有表达。其中，在肝、胰、肾、脑四个组织中表达量差距不大，均处于相对较低的水平，在肌肉组织当中，表达量最高，达到了肝脏当中的10.4倍。同时检测表明，Sox2基因虽在西伯利亚鲟胚胎发育各时期均表达，但表达具明显的时间差异性。在受精卵期、囊胚期Sox2基因的相对表达量较低，在原肠期、神经胚期、视泡形成期和心脏形成期Sox2基因相对表达量达较高，且在心脏形成期达到了最高点。
　　 本研究结果为今后深入研究西伯利亚鲟侧线发育过程中的神经分化发育、细胞迁移及其整个过程中特异性基因的时空表达提供了实验性资料。