稀有鮈鲫β-actin启动子的克隆及转基因技术在荧光稀有鮈鲫培育上的应用
稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)是我国特有的一种小型鲤科鱼类，并已作为一种新型的模式实验鱼应用于鱼病学、遗传学、环境科学等多个研究领域。其所具有的优良特性使其具备通过转基因技术开发培育类似于斑马鱼（Danio rer io）、青鳉（Oryzias latipes）等观赏鱼的潜在可能性。β肌动蛋白(β-actin)是主要的胞质肌动蛋白，目前已成功分离了多种鱼类的β-actin基因启动子，并在转基因鱼的应用研究中发现其具有很强的转录活性。本实验以稀有鮈鲫为对象，旨在分离其具有较强转录活性的启动片段，并构建转基因荧光稀有鮈鲫，主要的研究内容如下：
1.本研究使用4种化学脱粘剂对稀有鮈鲫的粘性受精卵进行脱粘处理，结果发现1.5％Na2SO3+0.2％木瓜酶的化学脱粘剂能快速脱去稀有鮈鲫粘性受精卵的粘性，且不影响胚胎正常发育，.是显微注射等后续实验操作的首选。
2.采用PCR方法，从稀有鮈鲫基因组DNA中分离得到大小为1584bp的β肌动蛋白(β-actin)基因片段。序列分析表明，该片段包括长为1507bp的启动调控区和77bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为109bpβ-actin基因上游调控序列，不翻译的外显子1和内含子1。上游调控序列中含有TATA box，CAATbox和CArG box等与转录活性密切相关的作用元件，并且在稀有鮈鲫β-actin基因第一个内含子中也含有一个CArG调控元件。
3.将分离得到的启动子片段克隆到绿色荧光表达载体(pAcGFPl-1)上，得到重组质粒β-actin-AcGFPl。通过显微注射将线性化的重组表达载体导入经1.5％Na2SO3+0.2％木瓜酶脱粘的稀有鮈鲫受精卵中，利用荧光显微镜能观察到绿色荧光蛋白的表达，其中阳性率最高为7.69％，表明所分离的稀有鮈鲫β-actin基因启动子片段具有一定的转录活性。
4.采用基因组步移(Genome Walker)技术，根据已克隆得到的1584 bp的稀有鮈鲫β肌动蛋白基因启动子序列，进一步得到5'上游1704bp的侧翼序列。对其进行序列分析表明，该片段中包含MyoD、USF、YY1、Sp1、MEF-2等多个潜在的转录因子结合位点。将该序列同其他鲤科鱼类进行在线比对后发现，在转录起始位点上游-110bp至-175bp处的序列具有较高的相似性，其中可能还包含有2个USF位点和1个E-box。以稀有鮈鲫基因组DNA为模板，根据所得片段和已克隆的启动子序列设计引物，进一步获得了稀有鮈鲫β-actin基因启动调控序列。
本实验探索了化学脱粘液处理稀有鮈鲫粘性受精卵的方法，成功克隆了稀有鮈鲫1584 bp的β-actin基因启动子及其5'上游1704bp序列，并证实了1584bp的β-actin基因启动子片段具有一定的启动外源基因转录的活性，为构建具有观赏价值的转基因荧光稀有鮈鲫奠定了基础。
- 作者：
- 叶斐菲
- 学位授予单位：
- 上海海洋大学
- 专业名称：
- 海洋生物学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2010年
- 导师姓名：
- 蔡生力
- 中图分类号：
- Q959.468；S965.116