流感病毒离子通道蛋白M2以及人胰腺磷脂酶A2酶原的结构生物学研究
A型流感病毒的M2离子通道蛋白分布于流感病毒表面，是由97氨基酸组成的跨膜蛋白，为同源四聚体。经预测，1-22位氨基酸位于胞外，23-46位氨基酸属于跨膜区域，47-97位氨基酸位于胞内。在流感病毒的生活周期中，当流感病毒被细胞内吞后，晚期内涵体中pH下降使M2离子通道打开，氢离子流入病毒颗粒中。病毒颗粒中pH值下降，促使病毒脱颗粒，同时低pH是流感病毒发生构象变化并实现膜融合的关键。到目前为止，国际上多个实验小组从固态NMR、液相NMR、X-射线晶体衍射以及分子动力模拟计算等方法来研究M2离子通道蛋白的结构，来阐明M2离子通道的组成、离子通道传递机制、抗药机制等。但在离子通道开关机制、抑制剂的结合位点等方面还待进一步深入研究。本研究在多个表达系统中对M2蛋白进行表达尝试，目的是获得足够量的目的蛋白进行晶体筛选，进一步的进行结构生物学研究。结果如下：(1)、在哺乳动物细胞中表达了M2与抗体片段Fc的融合蛋白，研究表明，M2-Fc融合蛋白不能有效的分泌到培养基中，仅在胞内或膜上表达，经亲和纯化后表明表达量约为100μg/ml-1mg/ml。(2)、在杆状病毒表达系统中，我们获得了表达与His融合的多个不同方式融合蛋白的病毒株，经表达量初步测试，并对部分病毒株表达的目的蛋白进行纯化，发现表达的目的蛋白在分子筛层析柱上表现为八聚体，并且表达的目的蛋白存在细胞膜上，蛋白抽提较为困难。(3)、在原核表达系统中，GST融合的H5N1型的M2蛋白获得了高效表达，但是M2与GST酶切后很难经层析柱去除。(4)、Trx融合的H3N2型的M2融合蛋白也获得了高效表达，对多个不同表达片段的表达测试后，最后对其中两个片段进行了大量纯化和结晶筛选。目前尚未获得晶体。
磷脂酶A2(PLA2)是一类具有催化甘油磷酸脂sn-2位酰基水解活性的酶类家族。目前在哺乳动物体内已经发现的PLA2可划分为五大类，分别是：分泌型磷脂酶A2，胞浆型磷脂酶A2，Ca2+非依赖型磷脂酶A2，血小板激活因子乙酰水解酶和溶菌PLA2，根据酶活机制和功能结构关系分为至少19种亚型。胰腺磷脂酶A2(G1B)属于分泌型磷脂酶A2家族成员。功能实验表明，人G1B是一个治疗肥胖、糖尿病的潜在药物靶标。人胰腺磷脂酶A2酶原(pro-hG1B)可以通过剪切前导肽(PROP)而激活为hG1B。pro-hG1B的激活方式还有待解决。本课题选取了毕赤酵母表达系统进行pro-hG1B的表达。经重组子筛选、表达优化获得了pro-hG1B高表达的重组酵母菌株；通过离子交换和分子筛层析技术纯化得到了高纯度pro-hG1B；进一步晶体筛选获得了可衍射晶体；最后通过分子置换法解析了结构，获得了分辨率为1.55A的pro-hG1B结构模型。辅以体外生化试验结合高分辨晶体结构，发现：(1)活性位点被前导肽PROP占据，并且缺失了文献报道的活性位点附近的、保守的功能水分子。(2)质谱、SDS-PAGE均显示pro-hG1B的PROP序列在37°C存在一定程度的自我剪切，通过结构分析，推测这种自我剪切是Asp49-Arg0-Ser(-2)三联体发挥作用的结果，该剪切机制与丝氨酸蛋白酶剪切机制相似。(3)晶体结构显示pro-hG1B在晶体中以三重对称排列。PISA服务器分析表明pro-hG1B为稳定的三聚体。体外DLS实验进一步证实，pro-hG1B在高于7.5mg/ml时能够形成三聚体，而在3.7mg/ml以下主要以单体形式存在；而对hG1B的观察发现，只有浓度达到30mg/ml时才能形成三聚体。(4)69环区域排列有序，构象与其他报道有显著区别，可能参与了酶作用过程中的构象变化。(5)结合体外生化实验结果与晶体结构特征，提出了一种新的PLA2膜结合激活机制。
- 作者：
- 徐伟
- 学位授予单位：
- 中国科学院广州生物医药与健康研究院
- 专业名称：
- 生物技术与医药
- 授予学位：
- 博士
- 学位年度：
- 2009年
- 导师姓名：
- 陈凌；刘劲松
- 中图分类号：
- R978.7
- 关键词：
- 磷脂酶A
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