东祁连山高寒草地优势植物内生细菌多样性研究

本研究以东祁连山高寒草地的代表类型珠芽蓼草地、嵩草草地和禾草草地上的5种优势植物秦艽、线叶嵩、珠芽蓼、乳白香青和紫花针茅为研究对象，采用微生物学传统分离培养法、生理生化测定方法以及分子生物学技术，研究其内生细菌的功能多样性、生理代谢多样性、遗传多样性、生态分布多样性。同时，研究了5种高寒植物体内内生细菌的群落多样性及动态，主要获得以下研究结果：
　　 1.可培养内生细菌功能多样性
　　 本文从分离到的150株高寒植物可培养内生细菌中筛选出：固氮菌11株；解磷菌7株，分别是：Bacillus sp.、Stenotrophomonas sp.、Paracoccussp.和未鉴定的2个分离物；具有分泌IAA能力的菌22株，分别是：Bacillus sp.、Lysinibacillus sp.、Promicromonospora sp.和未鉴定的10株分离物; 具有分解纤维素能力的菌有18株，分别是：Bacillus sp.、Lysinibacillus sp.、Paenibacillus sp.和未鉴定的10株分离物。其中，部分菌株兼有两种功能，Bacillus sp.具有固氮和分泌IAA的功能，Bacillus sp.具有固氮和分解纤维素的功能，Bacillus sp.具有溶磷和分泌IAA两种功能，Bacillus sp.、ZC5和ZHA10具有分泌IAA和分解纤维素的功能。表明高寒植物可培养内生细菌具有丰富的功能多样性。
　　 初步探讨了解磷菌RA8的解磷机理，测定了其对土壤复杂磷源的溶解能力和对玉米的解磷促生能力，结果表明，RA8在PKO培养基中的解磷量为315.36 mg/L，RA8代谢产生的酸使难溶磷部分溶解，但RA8解磷的主要机制不是有机酸溶解难溶磷。RA8在未灭菌土壤中的解磷量为115.53 mg/L，在灭菌土壤中的解磷量为77.60 mg/L。RA8可使玉米的株高和株重显著增加，对玉米的生长有促进作用。
　　 对分泌IAA能力最强菌株LZHA4和分解纤维素能力最强菌株X5的培养条件进行了优化，结果，LZHA4在King+葡萄糖6g/L+色氨酸0.1gm培养基中分泌IAA量最大，为129.68 mg/L，在King+葡萄糖6g/L培养基中分泌IAA量为118.94 mg/L，两者没有显著差异，考虑到成本因素，LZHA4分泌IAA的最佳培养基为King+葡萄糖6g/L。菌株X5产纤维素酶的最佳培养基为蛋白胨和酵母粉各5g/L、羧甲基纤维素钠5g/L、pH值为8.5，培养温度为20℃。在该条件下测得菌株X5产生的纤维素酶的酶活性为0.862U，是优化前的酶活性的1.89倍。
　　 2、可培养内生细菌遗传多样性研究
　　 研究获得的102株细菌的16SrDNA基因序列，已在GenBank中登录，并获得了菌株Azotobacter chroococcum1.178和Bacillus sp.、Acinetobacter sp.、Lysinibacillus sphaericus的n/fn基因序列，亦在GenBank中登录。根据16S rDNA序列分析，芽孢杆菌属细菌有57株，占已鉴定内生菌的55.9％，为优势菌群；Sphingopyxis属有7株，占6.9％，沙雷氏菌属有4株，占3.9％，不动杆细菌属和Lysinibacillus各有3株，占2.9％；节细菌属、短小杆菌属、假单胞菌属、芽孢八叠球菌属、葡萄球菌属、土壤杆菌属、寡养单胞菌属、贪食菌属分别有2株，各占2％：鞘脂菌属、鞘脂单胞菌属、微小杆菌属、考克氏菌属、微球菌属、土地杆菌属、副球菌属、叶杆菌属、类芽胞杆菌、原小单孢菌属各仅有1株，占1％。共24属，其中5个属的13个菌系的植物内生细菌系首次报道。说明高寒植物可培养内生细菌具有丰富的遗传多样性。
　　 3、各高寒植物可培养内生细菌群落分布多样性
　　 从5种高寒植物可培养内生细菌种类特征看，有a-proteobacteria、β-proteobacteria、γ-proteobacteria、高G+C含量的革兰氏阳性细菌、低G+C含量的革兰氏阴性细菌和嗜纤维菌/黄杆菌/拟杆菌群六大类群的内生细菌，其中LGC类群的多样性最丰富，占所测菌株的63.7％，分属在7个属中；从不同草地类型和各植物内生细菌的群落结构来看，不同草地类型间的植物内生细菌群落既有相同类型又有较大差异，同一类型草地不同植物体内的内生细菌群落相似性较高，但又有各自的特有类群，如嵩草草地上的优势植物秦艽和线叶嵩内生细菌群落都有γ-proteobacteria、HGC和LGC三个类群，而α-proteobacteria为秦艽特有类群，CFB为线叶嵩特有类群；珠芽蓼草地的优势植物乳白香青和珠芽蓼内生细菌群落都有α-、β-、γ-proteobacteria和LGC四个类群，而HGC为乳白香青特有类群，体现出植物内生细菌群落生态分布的多样性，也表明内生细菌在植物中的分布与植物的生物学特性和植物生长的生态环境有关。
　　 4、高寒植物可培养内生细菌在宿主体内分布多样性
　　 从高寒植物可培养内生细菌在宿主体内分布看，各植物的不同器官内生菌的数量和种类表现较丰富的生态分布多样性，如在珠芽蓼体内，共有13个属的内生细菌，其中根中内生菌种属最多，有8个属，其次是花和叶，茎中最少，只有芽孢杆菌属的细菌；乳白香青内生细菌分属于9个属，叶中内生细菌种属最多，有6个属，其次是根和茎，花中最少，有2个属：线叶嵩内生细菌分属于8个属，根中内生菌种属最多，有7个属；秦艽内生细菌分属于7个属，茎中内生菌种类最多，有4个属，其次是根，叶和花中只有2个属；紫花针茅4个属，根中内生菌种属最多，有3个属，叶中最少，只有芽孢杆菌属的细菌。
　　 5、生理代谢多样性
　　 选择了优势属--芽孢杆菌中的10个代表菌株，测定其对碳源、氮源和大分子物质的利用能力，结果表明，10菌株内生芽孢杆菌对物质的利用能力差异很大，表现出其生理代谢的多样性。菌株Bacillus sp.、B.subtilis和B.pumilus对供试的葡萄糖、甘露醇、木糖和阿拉伯糖均能利用；菌株B.cereus只能利用葡萄糖；菌株Bacillus sp.和B.spaericus对供试的4种单糖均不能利用。菌株B.cereus能利用蔗糖，B.cereus不能利用蔗糖。菌株B.cereus能利用柠檬酸盐，菌株B.cereus不能利用柠檬酸盐。菌株B.subtilis、B.cereus、Bacillus sp.能还原硝酸盐，B.pumilus、B.spaericus和Bacillus sp.则不能还原硝酸盐；菌株Bacillus sp.和B.cereus能利用色氨酸产生吲哚，其余菌株则不能利用色氨酸；菌株B.cereus、B.subtilis和Bacillus sp.能水解淀粉，B.pumilus、B.spaericus和Bacillus sp.不能水解淀粉；只有菌株B.subtilis能分解纤维素，B.subtilis等9株菌不能分解纤维素；只有菌株B.spaericus不能水解酪素。结果表明，芽孢杆菌中不同种和同种的不同菌株在生理代谢上均存在丰富的多样性。
　　 6、DGGE分析5种高寒植物内生细菌群落动态
　　 提取获得的各高寒植物总DNA，经巢式PCR扩增和变性梯度凝胶电泳分析植物不同生长时期内生细菌的群落动态，结果表明，7月份5种植物内生细菌的香浓-威纳多样性指数在1.153-1.533之间，9月份5种植物内生细菌的香浓-威纳多样性指数则为1.127-1.502；同一种植物在不同生长时期，其内生细菌群落的香浓-威纳多样性指数、均匀度和丰富度等指标存在差别。线叶嵩、珠芽蓼和紫花针茅内生细菌群落的多样性指数7月份大于9月份；乳白香青则相反，9月份大于7月份，而秦艽在7月和9月的多样性指数相同；5种植物在生长季节的7、9月中内生细菌群落相似性较低，相似性均小于60％。秦艽和线叶嵩则在7月和9月中内生细菌群落变动较小，即内生细菌群落相似性较高；而乳白香青、珠芽蓼和紫花针茅的内生细菌群落在7月和9月有较大的变动。表明不同植物在不同生长时期，内生细菌的群落结构均有较大差异，具有多样性。
　　 7、PCR-RFLP分析珠芽蓼内生细菌多样性
　　 选用两种限制性内切酶HhaⅠ和HaeⅢ对珠芽蓼内生细菌的16S rDNA基因克隆片段进行RFLP分析，并对谱带差异明显的克隆进行测序。结果表明珠芽蓼内生细菌共形成α-、β-、γ-、δ-proteobacteria、HGC、LGC和CFB七大类群，与可培养的珠芽蓼内生细菌类群相比，采用PCR-RFLP法获得的内生细菌种类更丰富，除获得与可培养内生细菌相同的类群外，还获得了特有的δ-proteobacteria、HGC和CFB等类群的细菌信息，表明在珠芽蓼体内还存在较丰富的不可培养内生细菌。本试验用引物799f-1492r成功的从秦艽、线叶嵩、珠芽蓼、乳白香青和紫花针茅5种植物的组织总DNA中扩增出了内生细菌的16S rDNA基因片段，证实了引物799f-1492r能有效地排除植物叶绿体和线粒体DNA的干扰，可以更广泛的应用于多种植物内生细菌的研究中。
　　 本试验通过对高寒草地优势植物内生细菌多样性的研究，证明高寒植物体内生存着大量的不可培养和可培养的细菌种类，具有丰富的遗传、生理代谢和功能多样性，因此，本研究为高寒草地植物内生菌这个潜力的、尚待开发的微生物新资源的开发提供了理论依据和丰富的基础研究。