CDK2、CyclinE2和EGFP的融合表达载体的构建及表达
目的：克隆小鼠的Cdk2基因和cyclin E2基因,构建融合表达CDK2、Cyclin E2和增强型绿色荧光蛋白EGFP的真核表达载体pEGFP-Cdk2和pEGFP-cyclin E2,并确定其在真核细胞中的表达情况,为进一步在体内研究CDK2对减数分裂过程的亚细胞定位及作用机制奠定基础。
方法：从小鼠睾丸组织中提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增Cdk2基因和cyclin E2基因,分别将两个基因连接克隆到pMD19-T载体,经限制性内切酶酶切鉴定正确后测序。测序正确后,亚克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,构建pEGFP-Cdk2和pEGFP-cyclin E2真核表达载体,单双酶切鉴定。将重组载体及空载体pEGFP-N1用脂质体转染的方法导入山羊胎儿成纤维细胞中,观察48小时后绿色荧光的表达情况。并用G418筛选4周,以筛选阳性克隆。
结果：测序证明克隆的Cdk2和cyclin E2序列正确,酶切鉴定证实pEGFP-Cdk2和pEGFP-cyclin E2中目的基因片段和载体DNA大小,方向和插入位点均正确。转染山羊胎儿成纤维细胞后观察到绿色荧光蛋白表达。G418筛选到发光细胞克隆。
结论:1.成功克隆小鼠的Cdk2基因和cyelin E2基因；2.成功构建pEGFG-Cdk2和pEG-FP-cyclin E2融合表达载体；3.重组载体转染真核细胞后报告基因的表达,进一步证明重组载体构建成功；4.该载体的成功构建可以为进一步在体内研究CDK2和Cyclin E2在减数分裂中的蛋白定位及探讨CDK2对减数分裂的作用机理奠定实验基础。
- 作者：
- 刘新凤
- 学位授予单位：
- 内蒙古医学院
- 专业名称：
- 免疫学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2010年
- 导师姓名：
- 关泽红
- 中图分类号：
- R392.12；R714.51
- 关键词：
- 周期蛋白依赖性激酶2；细胞周期蛋白E2；融合蛋白；基因克隆；基因表达；亚细胞定位；减数分裂
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