乌鳢和鲈鱼胃蛋白酶原的分离纯化与酶的性质研究

鱼类消化酶的生理、生化特征研究是鱼类研究的重要内容之一。随着鱼类养殖业的发展，特别是网箱养殖的增多，对人工饵料的配制及投放提出了更高的要求。鱼类消化酶对其食物的消化吸收至关重要，酶的种类、数量、分布情况等信息是酶学研究的基础，而酶活力是反映鱼类消化酶生理机能的一项重要指标。作为鱼类的主要消化酶，胃蛋白酶的研究对养殖鱼类饲料研发具有重要的指导意义。
　　 本文以淡水乌鳢和海产鲈鱼为研究对象，通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel阴离子交换层析以及Sephacryl S-200凝胶层析等方法从这两种鱼胃中分别纯化得到三种不同的胃蛋白酶原，并对其相应的酶学性质进行了比较研究。
　　 实验结果表明：
　　 1.本实验分别纯化得到了乌鳢和鲈鱼的三种胃蛋白酶原，依次为PG1、PG2、PG3。
　　 以52克乌鳢胃为原料，得到纯化的蛋白酶原量分别为0.8mg、1.7mg、2.2mg。以40克鲈鱼胃为原料，得到纯化的胃蛋白酶原量分别为12.0mg、10.2mg、8.1mg。乌鳢胃蛋白酶的比活力较高，是鲈鱼的3-4倍。
　　 2.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示纯化的三种乌鳢胃蛋白酶原的分子量分别为37、38、36 kDa，与其相应胃蛋白酶的分子量分别为32、33、31 kDa；纯化的三种鲈鱼胃蛋白酶原的分子量分别为35、37、34 kDa，与其相应的胃蛋白酶的分子量分别为30、31、30 kDa。通过双向电泳(2D-PAGE)得到乌鳢三种胃蛋白酶原的等电点分别为4.8、4.4、4.0，鲈鱼三种胃蛋白酶原的等电点分别为5.3、5.1、4.7。蛋白酶谱分析(Zymography)显示乌鳢和鲈鱼的三种胃蛋白酶有不同的迁移率和不同的底物反应强度。
　　 3.在酸性条件下胃蛋白酶原转化为它们相应的活性形式的胃蛋白酶，通过不同时间间隔的酸化反应可以看到胃蛋白酶原向胃蛋白酶转化的全过程。其中，乌鳢和鲈鱼的PG1和PG2都通过中间态才转化为相应的活性形式，而两种鱼的PG3均不需经中间态而直接转化为其活性形式。
　　 4.以2％酸变性牛血红蛋白为底物，乌鳢三种胃蛋白酶的最适pH分别为3.0、3.5、3.0，最适温度分别为45℃、40℃、40℃；鲈鱼三种胃蛋白酶的最适pH分别为3.0、2.5、3.0，最适温度分别为35℃、30℃、30℃。温度超过50℃时胃蛋白酶的稳定性开始下降，pH7.0时胃蛋白酶的活性也很低。在活性较低条件下胃蛋白酶的自身降解能力也较弱，因此测定了在50℃、pH7.0时两种鱼胃蛋白酶的稳定性，得到乌鳢胃蛋白酶的半衰期分别为110、40、17 min；鲈鱼胃蛋白酶的半衰期分别为35、2、50min。
　　 5.纯化得到的六种胃蛋白酶原都属于天冬氨酸蛋白酶，pepstatin A作为一种典型的天冬氨酸蛋白酶抑制剂对它们都产生有效的抑制作用，但pepstatin A对六种酶抑制的灵敏性略有差别，当pepstatin A与乌鳢胃蛋白酶的摩尔比分别为1∶1、2∶1、4∶1时能完全抑制酶活性；当pepstatin A与鲈鱼胃蛋白酶的摩尔比分别为2∶1、4∶1、2∶1时能完全抑制酶活性。
　　 6.动力学参数测定结果表明，乌鳢胃蛋白酶对酸变性牛血红蛋白的米氏常数(Km)分别为9.8×10-5 mol/L、6.0×10-5mol/L和1.4×10-4 mol/L，催化常数(kcat)分别为8.24s-1、4.02 s-1和13.2 s-1，专一性常数(kcat/Km)分别为8.4×104 mol-1·L·s-1、6.7×104 mol-1·L·s-1和9.5×104 mol-1·L·s-1。鲈鱼胃蛋白酶对酸变性牛血红蛋白的Km值分别为5.5×10-5mol/L、1.2×10-4mol/L、3.8×10-5 mol/L，kcat值分别为7.34s-1、7.04 s-1和3.09 s-1，kcat/Km值分别为1.3×105 mol-1·L·s-1、5.9×104 mol-1·L·s-1和8.1×104 mol-1·L·s-1。
　　 7.蛋白免疫印迹反应(Westernblot)表明抗黄鳍鲷PG-Ⅰ和PG-Ⅱ多克隆抗体可与乌鳢PG1和PG2发生较强免疫交叉反应，与乌鳢PG3反应较弱，而抗黄鳍鲷PG-Ⅲ多克隆抗体与乌鳢的三种胃蛋白酶原均不发生免疫交叉反应。抗黄鳍鲷PG-Ⅰ和PG-Ⅱ多克隆抗体可与鲈鱼PG1发生较强免疫交叉反应，与鲈鱼PG2和PG3反应较弱，抗黄鳍鲷PG-Ⅲ多克隆抗体与鲈鱼三种胃蛋白酶原仅有微弱的免疫交叉反应。
　　 8.本实验测定了乌鳢三种胃蛋白酶原的N末端部分氨基酸序列，PG1为LIQVPLEKGKTAREILEEKGLWDEYRLKTPTNPM，PG2为LIQVPLEKGKTAREILEEKGLWDEY，PG3为LVRMPLIKGKTARQTLQEKGLWEEYRKK。测定了鲈鱼三种胃蛋白酶原与相应胃蛋白酶的部分氨基酸序列，PG1为FIQVPLEKGKSAREFLEEQGLWEEYYLKKP,PG2为 VFRVPLQKHKSIIEELLDDGIEMMYYDDAA，PG3为FHRIPLIKGKTARRALQEKKLWDDFRM，P1为AVGDESMTNDADLAYYGVI，P2为YINNYADTTYFGA，P3为IQSGTEPMTNDAD。通过同源性比较发现，乌鳢的三种胃蛋白酶原的同源性较高，而鲈鱼的三种胃蛋白酶原的同源性只有25％-45％，进一步证实了本实验所纯化的胃蛋白酶原是互不相同的。对两种鱼六种胃蛋白酶原与其它物种胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性也进行了比较分析。
　　 9.体外模拟鲈鱼胃液消化实验结果显示，鱼、虾肉总蛋白在鲈鱼胃液条件下能发生较强分解。