报告基因HSV1-tk的PET探针的合成及其生物学评价

报告基因HSV1-tk的PET显像可以定量、反复、无损伤地反映活体体内治疗基因的转染效率、转染组织特异性和体内表达持续时间，以及对基因治疗中载体的分布和转导基因的有效性等进行评价，因而可指导基因治疗方案的优化和评价基因治疗的效果。报告基因与其分子探针是实现该报告基因PET分子显像必备的两个因素，研制报告基因HSV1-tk特异性PET分子探针是其PET显像成功关键所在。为了发展制备方法更简单、灵敏度更高、选择性更好的PET报告基因HSV1-tk分子探针，本课题发展了一种新颖的、高效的一步法F-18亲核取代标记方法，运用此标记方法制备了报告基因HSV1-tk新型PET分子探针核苷类似物2-氨基-6-[18F]氟-9-(4-羟基-3-羟甲基丁基)嘌呤([18F]FPCV)，并对其进行了质量控制和体外体内生物学评价以及micro-PET显像研究。同时制备报告基因HSV1-tk的PET经典分子探针[18F]FHBG。
　　 本文首先通过对原料药2-氨基-6-氯-9-(4-乙酰氧基-3-乙酰氧甲基丁基)嘌呤水解脱去乙酰基、与三甲胺乙醇溶液反应得到相应的氯化铵盐、再与KF反应，制得[18F]FPCV的参比化合物2-氨基-6-氟-9-(4-羟基-3-羟甲基丁基)嘌呤(6-FPCV)。以核苷氯化三甲基铵盐作为标记前体，一步法F-18亲核取代三甲基铵盐，放射性合成6-[18F]FPCV。其优化的实验条件是：m(K2.2.2)：m(K2CO3)=10：1、1 mL DMF作溶剂、反应温度为60℃、反应时间为15 min。经Silica plusSep-Pak cartridge分离纯化，得到纯6-[18F]FPCV，总合成时间约为35～42 min。放射性化学产率约为45—55％(n=6，未经衰变校正)，放射化学纯度大于98％，比活度大于5.62GBq/μmol。
　　 其次研究6-[18F]FPCV体外生物学评价实验，包括分配系数的测定、体外稳定性实验、药代动力学实验以及体外细胞摄取实验。6-[18F]FPCV体外生物学实验表明：6-[18F]FPCV在PBS、小牛血清中稳定性较好，在孵育360 min后，其放射化学纯度仍保持在90％以上；6-[18F]FPCV的分配系数Log P=-0.517；6-[18F]FPCV在小鼠体内的药代动力学符合简单的二室模型，计算得到6-[18F]FPCV的分布相半衰期T1/2(α)=1.2 min，清除相半衰T1/2(β)=73.7min；探针6-[18F]FPCV在C6-tk细胞中摄取率比对照组C6细胞高5.5～18.8倍，其细胞摄取率的增加是由于细胞中HSV1-tk表达量的增加，说明探针可以应用活体内HSV1-tk的表达的显像。
　　 然后研究6-[18F]FPCV的体内生物学行为及micro-PET显像，6-[18F]FPCV体内生物学评价实验表明：探针6-[18F]FPCV在正常小鼠体内能迅速地分布到全身，并能较快地清除，经肝、肾代谢，但探针6-[18F]FPCV在体内60 min后代谢易脱氟；探针6-[18F]FPCV在肿瘤模型裸鼠体内15 min前的稳定性较好，未见放射性代谢物，在C6-tk肿瘤和C6肿瘤中吸收值也比较高，其比值最高为1.69，经放射自显像证实6-[18F]FPCV在C6-tk肿瘤中吸收明显高于在C6肿瘤中的吸收，说明探针6-[18F]FPcv在转染报告基因HSV1-tk的C6-tk肿瘤中有特异性聚集。micro-PET显像实验表明：与[18F]FDG的micro-PET显像相比，注射6-[18F]FPCV15 min后，其在C6-tk肿瘤和对照组C6肿瘤中摄取差异明显(其比值为1.5左右)，可用于HSV1-tk的早期micro-PET显像，但由于6-[18F]FPCV在体内60 min后脱氟行为明显等原因，尚需作进一步研究后，才能用探针6-[18F]FPCV对体内报告基因HSV1-tk进行较长时间的micro-PET连续显像。
　　 最后从抗疱疹病毒药物喷昔洛韦出发，与4-甲氧基氯化三苯甲烷反应保护氨基及一个羟基、另一个羟基磺酯化，再经氟化、水解四步反应合成了9-(4-[18F]氟-3-羟基甲基丁基)鸟嘌呤([18F]-FHBG)的标记前体Tosyl-FHBG及参比化合物9-(4-氟-3-羟基甲基丁基)鸟嘌呤(FHBG)。标记前体Tosyl-FHBG经两步放射性反应合成报告基因HSV1-tk的PET经典分子探针[18F]FHBG，并建立了Sep—PakCartridge分离方法取代常用的HPLC分离纯化方法。[18F]FHBG整个反应时间90～100 min，经衰变校正总产率为9±3％(n=6)，放化纯度＞97％。