川芎组织培养中次生代谢产物阿魏酸的检测及其对大脑损伤的保护作用

川芎系伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort的干燥根茎，具有活血化瘀，驱风止痛之功效。据化学分析，川芎含生物碱、挥发油、酚性成分、内酯类等多种成分，其中所含的川芎嗪(四甲基吡嗪，Tetramethylpyrazine，TMP)和阿魏酸(Ferulie acid)是川芎中的主要药效成分。现代药理证明，阿魏酸具有降低血小板聚集、改善急性心肌缺血、改善微循环、增加冠脉及脑血流量、增强免疫等作用，在临床上被广泛用于治疗心脑血管系统、血液系统、泌尿系统、呼吸系统等方面的疾病。虽然近年来川芎人工栽培面积不断扩大，但不合理的采集和自然生态环境的恶化，造成人工栽培面逐年的减少，现已难以满足临床治疗和制药企业的需求。因此，利用现代纽胞工程技术对川芎进行细胞和组织培养已成为解决问题的又一途径。本文从以下两个方面开展了实验研究： 1、探索川芎组织培养的实验条件及染色体核型分析： 以川芎叶柄为外植体，研究了川芎愈伤组织诱导的培养条件和继代培养次数对川芎次生代谢产物形成和积累的影响，并对愈伤组织的染色体进行了初步的分析。结果表明：诱导川芎叶柄愈伤组织的基本培养基为MS培养基，适宜生长素为浓度2.0 mg/L 2,4-D 及 0.4 mg/L 6-BA；愈伤组织的继代培养适宜培养基为1/2MS+2,4-D(0.5mg/L)；染色体的核型公式为K(<,2n>)=2X=22=16m+4sm+2st(SAT)，其中8对中部着丝点染色体(m)，2对近中部着丝点染色体(sm)，1对近端部着丝点染色体(st)；随着培养时间的增加，次生代谢产物含量在递增。 2、探讨阿魏酸对大脑损伤的保护作用及其作用机制： 在建立小鼠颅脑损伤模型及通过海马注射聚集A β肽+KA建立痴呆大鼠模型的基础上，采用灌胃给药方式来观察阿魏酸对两种实验动物模型的作用，并对其机制进行简要探讨，以期为阿魏酸开发成脑损伤有效治疗药物提供实验依据。 ①阿魏酸对小鼠颅脑损伤的作用评价及其相关机制探讨： 选择健康昆明种小鼠60只，随机分为对照组、模型组、实验动物给药组(高、中、低剂量)五组。采用改良的Feeney自由落体损伤装置致小鼠颅脑损伤。各组的小鼠于造模后3 d后开始灌胃给药，每日1次。正常对照组及模型对照组均给予等量生理盐水灌胃，连续用药7 d。末次给药3 h后，拉颈处死小鼠，快速取大脑(剔除小脑)，用干湿重比法分别测脑含水量。将部分含损伤区脑片作冰冻切片，行HE、Nissle染色；利用比色法测定脑组织匀浆中NO和脑线粒体中ATP含量。结果表明：光镜下，正常对照组小鼠海马区组织结构正常，无水肿，神经细胞较为密集，胞体较丰满，胞浆丰富，核膜清楚，部分神经细胞核仁清晰，尼氏体丰富，胞浆透亮；模型组小鼠海马区出现不同程度水肿，神经细胞的胞浆和胞核界限不清，大部分核仁消失，尼氏体消失，组织内见有空泡出现；各药物组均有不同程度的损伤但是较模型组轻。颅脑损伤后小鼠脑组织的含水量明显增多，脑组织NO含量明显增高，而脑线粒体ATP活性明显下降，阿魏酸治疗后，上述现象均有所改善，即水肿现象减轻，NO含量降低，ATP酶活性增高。因此可认为：小鼠脑组织形态学观察结果表明，自由落体撞击鼠脑，可成功诱导小鼠颅脑损伤动物模型；阿魏酸可以通过减轻脑水肿、降低NO含量以及保护线粒体功能而减轻创伤性颅脑损伤后的继发性脑损害，从而改善预后。 ②阿魏酸对AD大鼠的作用评价及其相关机制探讨： 选择健康SD大鼠30只，实验设正常对照组、模型对照组、实验动物给药组(高、中、低剂量)五组。其中模型组和药物组动物利用脑立体定位技术，将凝聚肽Aβ<,1-40>和神经毒素KA对大鼠海马区进行定位注射以建立AD模型，而正常对照组大鼠同一部位注射等体积的生理盐水，以代替凝聚肽Aβ<,1-40>和神经毒素KA作为假手术对照。建模成功后，各药物组分别给予一定剂量的阿魏酸，而模型对照组与正常对照组则给予等量的生理盐水灌胃，连续用药20 d。末次给药后3 h，快速断头处死大鼠，在冰盘上快速取全脑，冰冷的匀浆介质清洗，滤纸吸干，制备成脑匀浆。检测大鼠脑组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的含量。结果显示：与正常对照组相比，模型组大鼠脑组织中SOD活性及GSH-PX活性下降，MDA含量升高，具有显著的统计学差异。而AD大鼠经FA治疗20 d后，与模型组相比，大鼠脑组织中SOD及GSH-PX活性均得到显著升高，而MDA含量明显下降。故认为阿魏酸作为一种抗氧化剂，可明显改善AD大鼠的抗氧化能力，提高SOD和GSH-PX活性，降低MDA，对脑组织的氧化损伤起到明显的保护作用，可用于AD的治疗。