结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64及38KD重组蛋白的表达、纯化及免疫活性研究
构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64和38KD的重组蛋白表达体，在大肠杆菌BL21中进行诱导表达，并对表达产物进行纯化和复性，同时对其进行免疫反应性进行分析，为探索重组蛋白在结核病血清学诊断和预防疫苗的应用奠定前期实验基础。以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的DNA基因组为模板，Taq聚合酶链反应分别扩增mpt64和38KD基因片段。将mpt64基因片段克隆于PKRX-T载体，经酶切和PCR鉴定后，mpt64基因片段再亚克隆于原核表达载体pET30a中，构建重组体pET30a-mpt64；将38KD基因片段直接进行酶切后克隆于表达载体pZT30a中，构建重组体pET30a-38KD。然后两者分别转化至表达宿主菌Ecoli BL21(13E3)，经酶切、PCR和测序筛选阳性克隆，挑选单个含重组质粒的工程菌阳性克隆进行培养和IPTG诱导表达，利用SDS-PAGE和Western-Blot进行分析和鉴定表达产物；Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白，并经半透膜透析复性，BCA法测定纯化蛋白浓度。用纯化复性的重组蛋白38KD作为抗原并包被微孔板，建立间接ELISA方法，检测结核分枝杆菌培养阳性病患者的血清，评价重组抗原在血清学诊断中的应用价值。 mDt64和38KD基因扩增后片段大小与目的基因相符：构建的重组质粒pET30a-mpt64和pET30a-38KD经酶切鉴定和测序鉴定后，证明其插入片段为目的基因。测序结果与Genbank登录序列比对后：mpt64基因99.9％、38KD基因100％的符合率；SDS-PAGE分析显示，在IPTG诱导下，重组工程菌表达蛋白分子量(Mr)分别为31 KD和43KD目的蛋白条带，目的蛋白在菌体细胞内主要以包涵体形式存在，占细胞总蛋白的20％～30％和55％，；经Ni-NTA亲和纯化获得了纯度在90％以上的重组蛋白;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构，Western-blot检测蛋白38KD能与结核分枝杆菌多克隆抗体发生特异性反应；以重组蛋白38KD为包被抗原建立间接ELISA法，检测30份结核病人血清，灵敏度约为43％。 结论： (1) 成功构建了重组原核表达体pET30a-mpt64和pET30a-38KD，将其转化奎大肠杆菌BL21后分别表达出分子量(Mr)约31KD和43KD的重组蛋白； (2) 成功纯化和复性MPT64和38KD蛋白的变性包涵体； (3) 38KD 重组蛋白具有良好的免疫反应性，能与结核分枝杆菌多克隆抗体特异性结合，可作为结核病血清学诊断试剂盒的侯选抗原之一。
- 作者：
- 刘忠华
- 学位授予单位：
- 石河子大学
- 专业名称：
- 农学 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2007年
- 导师姓名：
- 陈创夫；万康林
- 中图分类号：
- R378.911；R446.6
- 关键词：
- 结核分枝杆菌；分泌蛋白；免疫活性；基因克隆；结核病；血清学诊断；重组抗原
- mycobacterium tuberculosis；MPT64；38KD；clone；express；renaturation