小麦染色体BAC文库构建技术优化及小麦抗逆相关基因分子鉴定
细菌人工染色体文库 (bacterial artificial chromosome，BAC) 在基因组物理图谱构建、基因组测序、基因图位克隆以及基因结构和调控研究等方面发挥了巨大作用。本研究以普通小麦中国春端体5DL 为材料，通过对染色体流式分选技术、从分选染色体中获取高分子量 (high molecular weight，HMW) DNA及双元细菌人工染色体文库 (binary BAC，BIBAC) 构建技术优化，以完善小麦染色体特异文库构建技术体系。取得以下研究结果： 1、普通小麦中国春端体5DL 根尖细胞周期同步化：经1.25 mM 羟基脲 (hydroxyurea，HU) 处理18 h，随之进行6 h的恢复处理可将85﹪以上的细胞同步化，随后再经1μM氟乐灵(trifluralin)处理2.5 h，60﹪以上细胞被阻断在中期。 2、高质量染色体悬液制备结果：同步化的根尖细胞经2﹪多聚甲醛固定20 min，机械匀浆释放染色体并结合10﹪及30﹪蔗糖浓度梯度纯化释放的染色体悬液。利用该方法可获得染色体结构完整、细胞碎片含量少、背景清晰的染色体悬浮液，适合于流式核型分析。 3、普通小麦中国春端体5DL 的流式核型分析：结果表明普通小麦中国春端体 5DL 的流式核型除具有普通小麦的4个峰外(复合峰Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及染色体3B)，还存在一个额外峰。 4、染色体5DL 分选及鉴定：将中国春端体5DL流式核型图中额外峰染色体分选，采用特异的微卫星引物Xgwm174进行PCR，结果可得到一条233 bp的特异条带，同时结合对分选来自额外峰染色体镜检观察，表明分选的染色体正是端体5DL。 5、从分选染色体中获取HMW DNA：对复合峰染色体设门分选，并经2 U BamHI酶切3-10 min，可得绝大部分为50-300 kb的HMW DNA。 6、BIBAC载体容载能力检测：随机抽提50个克隆进行 NotⅠ完全酶切，插入片断大小可达100kb左右。 通过上述技术优化，初步建立了适合进行小麦染色体特异文库构建的技术体系。 干旱、高盐及低温是影响作物生长的三种主要非生物胁迫因子。Na<''+>液泡内区域化是植物特别是盐生植物适应Na<''+>毒害非常有效的手段，液泡型Na<''+>/H<''+>逆转蛋白在这一过程中起重要的作用。本研究对Na<''+>/H<''+>逆转蛋白及与逆境胁迫相关的激酶CDPKs、MAPKs的相关分子生物学功能进行鉴定，结果如下： 1、小麦Na<''+>/H<''+>逆转蛋白基因表达特性分析：根据 Na<''+>/H<''+>逆转蛋白基因序列设计引物进行半定量RT-PCR，结果表明小麦 Na<''+>/H<''+>转运蛋白在植物体内表达量与干旱、高盐及低温胁迫有关，而与ABA无关。 2、小麦Na<''+>/H<''+>逆转蛋白生物信息学分析：运用DNAMAN软件对小麦Na<''+>/H<''+>逆转蛋白跨膜结构域分析表明其存在11个跨膜结构域。 3、小麦Na<''+>/H<''+>逆转蛋白亚细胞定位分析：借助高效表达的绿色荧光蛋白(green fluorescenceprotein，GFP)载体16318GFP，将Na<''+>/H<''+>转运蛋白基因与之融合，通过微粒轰击进行Na<''+>H<''+>逆转蛋白亚细胞定位分析，结果表明Na<''+>/H<''+>逆转蛋白主要定位在液泡膜上。 4、依赖于钙离子的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases，CDPKs)CDPKI、CDPK2表达特性分析：采用半定量RT-PCR法进行CDPK1、CDPK2表达特性分析，结果表明CDPK1、CDPK2与干旱、高盐、低温及ABA诱导皆有关。 5、CDPK1及分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)原核诱导表达：将CDPK1及．MAPKs基因全长构建到原核表达载体pGEX-4T-1，诱导其在原核宿主菌内表达，结果表明：随着IPTG诱导时间的延长其表达量逐渐增加。CDPK1、MAPK1及MAPK2三种激酶的成功诱导将为下一步进行激酶激活功能验证做准备。 本研究通过对与抗逆相关基因几个方面的分子生物学功能鉴定，将在一定程度有助于理解一些小麦品种抗旱、耐盐及耐低温的分子机制，为小麦抗逆育种提供理论参考。
- 作者：
- 佘茂云
- 学位授予单位：
- 新疆农业大学
- 专业名称：
- 作物遗传育种
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2007年
- 导师姓名：
- 曲延英；马有志
- 中图分类号：
- S512.1
- 关键词：
- 染色体分选；BIBAC文库；流式核型；表达模式；细菌人工染色体文库
- chromosome sorting；BIBAC library；flow karyotype；Na+/H+ exchanger；expression mode