鸭肠炎病毒新基因的序列测定及其序列分析

本实验研究主要以蚀斑纯化株DEV Clone-03的基因组未知序列为主要对象，在试验中主要采用Targeted gene walking PCR的方法是以一段己知序列为锚定起始点，采用特异性引物与非特异性引物相结合的方法扩增己知序列周围的部分未知序列，随着序列的延伸并根据其设计新引物，从而使己知序列不断延伸。我们在原有的基础上，对扩增体系的条件进行了优化，试图获得更快的扩增效率，初步摸索了大片断扩增的方法，来增加扩增效率。 通过三个阶段的扩增，一共获得了DEV Clone-03 28 240 bp准确的基因组序列，用长ORF分析法和系统进化分析的方法首次确定了17个完整的ORF。其中UL区扩增得到24 659 bp片段，从中预测到14个基因ORF，它们编码的多肽分别与单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus 1，HSV-1)的UL8、UL9、UL10、UL11、UL12、UL13、UL14、UL15、UL16、UL17、UL18、UL19、UL20和UL21蛋白具有同源性，将这14个基因分别命名为DEV Clone-03的UL8、UL9、UL1O、UL11、ULl2、ULl3、UL14、UL15、UL16、UL17、UL18、UL19、UL20和UL21 HSV-1同源基因，各基因ORF大小依次为2271bp、2301bp、1170bp、264bp、1341bp、1575bp、1142bp、1947bp、1089bp、2055bp、912bp、4143bp、822bp、1686bp，编码氨基酸数量依次为756、766、389、87、446、524、383、648、362、684、303、1380、273和561。US区扩增得到3581bp的片段，从中预测到3个基因ORF，它们编码的多肽分别与MDV-1的蛋白具有同源性，将这3个基因分别命名为DEV Clone-03的MDV-1同源基因，各基因ORF大小依次为990bp、507bp和888 bp，编码氨基酸数量依次为329、168和295。除了UL20，其余基因均符合预计大小。 在疱疹病毒中尤其是a疱疹病毒中UL8～UL21基因的排列规律相对保守。我们分析发现DEVClone-03 UL8～UL21基因的排列与HSV-1和马立克氏病病毒血清Ⅰ型(Marek''s disease herpesvirus 1， MDV-1)同源基因的排列顺序相似，US区段与马立克氏病病毒血清Ⅰ型(Marek''s disease herpesvirus 1， MDV-1)同源基因的排列顺序相似，结合陈淑红师姐扩增鸭瘟病毒的基因序列，我们发现DEV基因组UL区段基因组成可能与马立克氏病疱疹病毒基因组UL区段基因组成相似。进一步对我们获得的序列综合分析，推测鸭瘟病毒的基因组结构与马立克氏病病毒血清Ⅰ型(Marek''s disease herpesvirus 1， MDV-1)的结构类似。 对以上17个基因进行同源性分析，结果表明：DEV Clone-03与α疱疹病毒同源性较之与β疱疹病毒和γ疱疹病毒的同源性要高。进一步分析发现，UL区段这13个基因的转录与单纯疱疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus 1，HSV-1)相同。在氨基酸系统发育进化树中，DEV Clone-03属于α疱疹病毒亚科，就UL8、UL9、UL10、UL12、UL13、UL14、UL15、UL18、UL19和UL20基因而言，DEV Clone-03与MDV更接近。因此，就UL8～UL21和US1～SORF3基因的综合序列分析而言，DEV Clone-03归属为α疱疹病毒亚科，与MDV更接近。因此预测DEV将来有可能归类为α疱疹病毒亚科的马立克氏病病毒属。当然，对于DEV归属的深入研究还需要大量的分子生物学资料和生物信息学为基础。 总之，本研究使用targeted．gene walking PCR方法和长片断PCR扩增的相结合，首次获得了鸭瘟病毒17个ORF的基因，这将为病毒基因组研究奠定基础，为 DEV 归属和致病性的深入研究提供资料。各个基因ORF核苷酸序列对基因的鉴定、基因产物的组成和功能的阐明具有重要的意义，特别是UL15、UL16、 UL17、UL18和UL19核衣壳基因组的发现为研究鸭瘟病毒核衣壳结构奠定了基础。为完善的诊断方法的建立和基因工程疫苗的研制提供分子生物学依据，从而更好地进行鸭病毒性肠炎的防制。本研究通过对区段的病毒基因组的研究应用生物统计学的方法对这一段序列从多个角度和不同层次进行了分析，从基因的角度研究鸭瘟病毒在疱疹病毒中的遗传演化关系，提供了可能，为鸭瘟病毒的分类提供依据，为鸭瘟病毒的深入研究打下坚实的基础。