从不同组织材料中获取人转化生长因子β1成熟肽基因的实验研究
目的：探寻获取TGF-β1成熟肽基因的方法，从人皮肤成纤维细胞、人外周血单核淋巴细胞、人血小板、人外周血及云南个旧肺腺癌GLC-82细胞等材料中扩增TGF-β1成熟肽基因，为构建TGF-βl成熟肽基因真核表达载体及核酸疫苗作基础。方法健康人包皮组织中获取并培养人皮肤成纤维细胞，培养云南个旧肺腺癌GLC一82细胞，收集人外周血、人血小板、人外周血单核淋巴细胞，用Triz01．提取各种细胞的总RNA；根据TGFo-β1的cDNA序列<''[0]>设计TGF-β1成熟肽基因上游引物P1为5’-CGGAATTCGCCCTGGACACCAACTATTGCTT-3’，含EcoRI酶切位点，下游引物P2为5’-TAAGCTTTCAGCTGCACTTGCAGGAGC&-3’，含有HindlII酶切位点，引物由Takara公司合成，扩增片段336bp。使用Takara公司RNA LA pCR<''TM>逆转录试剂盒扩增TGF-β1成熟肽基因。逆转录反应条件为：30℃，10分钟；42℃，50分钟；70℃，15分钟：PCR条件为：94℃变性反应2分钟：94℃变性反应30秒，55℃复性反应30秒，72℃延伸反应90秒，共30个循环，72℃后延伸反应10分钟。经琼脂糖凝胶电泳筛选与预期目的片段336bp大小相符的扩增产物，使用上海生工柱式DNA胶回收试剂盒回收330bp大小左右目的DNA片段，与pMDl8-T载体连接后送Takara公司测序。结果外周血扩增产物为252bp，为人17号常染色体上视紫红质抑制蛋白β<,2>：的等位基因中的一段：人外周血单核淋巴细胞扩增产物为425bp，为人11号常染色体上巴一比二氏综合征基因中的一段；人皮肤成纤维细胞扩增产物为310bp，为人12号常染色体上角蛋白丝结合蛋白基因序列中的一段。人血小板和云南个旧肺腺癌GLC一82细胞的总RNA经RT-PCR扩增后得到的片段大小与预期片段大小均不符，故未进行测序证实。 结论所设计的特异性引物未能从所选材料中得到目的基因。估计与所设计的引物特异性较差及所提取的总RNA中mRNA的丰度较低有关。
- 作者：
- 张碧华
- 学位授予单位：
- 昆明医学院
- 专业名称：
- 皮肤病与性病学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2006年
- 导师姓名：
- 吕昭萍
- 中图分类号：
- Q78
- 关键词：
- 转化生长因子β1；RNA；逆转录-聚合酶链式反应
- TGF-β1；RNA；RT-PCR