人甲状旁腺激素半抗原多肽诊断试剂的基础研究及表位分析
目的：1、对人甲状旁腺激素(1lPTH)诊断试剂的开发进行基础研究：①比较MBS和戊二醛两种方法连接PTH多肽．载体复合物，免疫家兔的特异性抗体和载体抗体的产生情况。②对PTH半抗原抗体的不同纯化方法进行比较研究；探讨酶标抗体的保护条件。从而为促进小分子多肽诊断试剂的国产化奠定基础。2、对hPTH尤其是N端肽抗原表位进行分析，了解抗原表位在hPTH多肽上的可能分布，为hPTH的临床应用、药动力学研究及诊断试剂的制备提供理论依据。 方法：1、PTH(1-84)直接作为免疫原，戊二醛一步法连接PTH(1-84)-BSA，以及MBS法连接PTH(44-68)-BSA作为免疫原，分别免疫家兔制备抗血清。2、使用戊二醛一步法和MBS法连接PTH-BSA制备的抗血清，ELISA法分析抗载体BSA抗体的产生情况。3、盐析，Q膜离子交换层析，蛋白A和特异性免疫亲和层析纯化PTH(1-84)抗体，将不同纯化方法得到的抗体进行回收率、免疫活性及纯度比较。4、HRP标记特异性亲和层析和盐析纯化的PTH(1-84)抗体；并比较不同保护剂对酶标抗体的作用。5、使用EIASA方法，通过不同多肽片段与抗体间的反应分析hPTH的抗原表位分布。 结果：1、兔抗PTH(1-84)抗血清ELISA效价达到1:10000，PTH(44-68)抗血清效价达到1:15000以上。2、MBS法制备的抗血清中，其抗载体蛋白BSA抗体效价小于1:10000，而戊二醛法BSA抗体效价在1:30000以上。3、四种纯化方法回收率比较：盐析>Q膜离子交换>蛋白A>特异性免疫亲和层析法；纯度与活性比较：特异性免疫亲和层析>蛋白A>Q膜离子交换>盐析。4、亲和层析的抗PTH(1.84)抗体标记HRP后，其特异性结合是盐析抗体的1.5倍，非特异结合相反是盐析抗体的50％。5、酶标抗体37℃放置三天后，加保护剂组活性明显大于未加保护剂组，且加BSA和进口保护剂活性大于甘油。6、ELISA法分析hPTH的抗原表位分布：PTH(1-4)、PTH(1-10)、PTH(13.24)、PTH(24-37)、PTH(1.34)、PTH(54-84)、PTH(44-68)及PTH(1-37)在固相状态下，与PTH(1-84)抗体的结合均呈增大趋势，且结合达到饱和时结合值为：PTH(1-84)>PTH(54-84)>PTH(1-34)>PTH(44-68)>PTH(13-27)>PTH(1-37)>PrFH(24-37)，PTH(1-4)和PTH(1-10)最低；固相化PTH(1-84)与抗PFH(54-84)抗体、PTH(44-68)抗体、PTH(1-37)抗体结合呈明显的剂量反应关系。结论：1、MBS法连接的免疫原复合物在动物免疫时，相比戊二醛法有以下优点：①有利于半抗原抗体的产生；②减少了抗载体抗体的生成；③抗血清中的抗载体抗体易于清除。因此MBS法是一种良好的制备半抗原免疫原的方法。2、蛋白A和特异性亲和层析纯化的PTH(1-84)抗体，纯度高，免疫活性好，但回收率低。盐析与Q膜纯化操作简便，条件温和，抗体回收率高，但其纯度及免疫活性较低。3、BSA，甘油和进口酶保护剂对酶标抗体均有保护作用，BSA和进口酶保护剂作用相近，甘油的保护作用较差。4、hPTH(1-84)的抗原表位分析：PTH氨基端(1-37)内含有一个较强的非连续性抗原表位，位于(13-27)区域内；含有两个较弱的连续性抗原表位，分别位于(24-37)和(1-10)区域内；而PTH(1-10)的表位由位于(1-4)区域内的连续性抗原表位构成。PTH羧基端(54-84)区域内含有一个以上的抗原表位，其中(44-68)区域内含有一个主要的连续性抗原表位。
- 作者：
- 王娜
- 学位授予单位：
- 北京积水潭医院北京市创伤骨科研究所
- 专业名称：
- 外科学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2004年
- 导师姓名：
- 赵丹慧
- 中图分类号：
- R582
- 关键词：
- 甲状旁腺激素；酶联免疫吸附测定；亲和层析纯化；辣根过氧化物酶
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