猪瘟间接ELISA和猪瘟及主要繁殖障碍病的荧光PCR技术的研究
对猪瘟抗体水平检测是制定合理的免疫程序，监测疫苗免疫效果的基础。本研究利用猪瘟病毒(CSFV)免疫优势蛋白E2蛋白具有4个独立的抗原结构域的特点，将E2的免疫活性区域进行原核表达。采用PCR技术，从已构建好的含有E2全长基因的S21质粒中分别扩增出E2蛋白的4个抗原决定域，并克隆入ptMAL-p2X载体中，构建了4个原核表达载体E2-abcd／pMAL-p2X、E2-ala2／pMAL-p2X、E2-b／pMAL-p2X和E2-c／pMAL-p2X。通过对四种表达菌的筛选，最后选择BL21-CodonPlus(DE3)-RP作为受体表达菌。电泳结果显示均获得可溶性表达，目的蛋白的表达量占总蛋白的15％-30％。将重组的目的蛋白进行亲和层析纯化，作为包被抗原，初步建立了检测猪瘟抗体的间接ELISA方法。实验证明，该方法对标准的CSF阳性及阴性血清的具有良好的敏感性。 猪瘟感染确诊的主要依据是对CSFV的实验室检测。因此，本研究设计了多种探针和引物，初步建立了双重实时荧光PCR技术，检测包括CSFV在内的4种可引起繁殖障碍的病毒，即猪瘟病毒(CSFV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)。实验证明，所设计的探针和引物具有良好的特异性。实时荧光PCR检测各种病原的敏感性试验结果显示，检测CSFVcDNA的敏感性达2-3，而nest-PeR的敏感性可达2-9；检测PRRSVcDNA的敏感性达2-2，而nest-PCR的敏感性可达2-5；实时荧光PCR检测PRV的敏感性可达10，而常规PCR方法可达10-4；检测PPV的敏感性达10-6，而常规PCR方法可达10-4。
- 作者：
- 徐璐
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2005年
- 导师姓名：
- 王泰健；王琴
- 中图分类号：
- S852.651；S854.43
- 关键词：
- 猪瘟病毒；E2蛋白；原核表达；实时荧光PCR；疫苗免疫
- classical swine fever virus；E2 protein；prokaryotic expression system；indirect ELISA；real time PCR