GDNF和GM1等体外联合诱导骨髓基质干细胞向DA能神经元分化的实验研究
本文应用胶质源性神经营养因子(GDNF)和单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)等体外联合诱导骨髓基质干细胞（MSCs）向DA能神经元转化，目的是寻求体外诱导MSCs定向分化为多巴胺(DA)能神经元的最佳条件，为PD的细胞及基因治疗奠定实验基础。 方法：取雄性Wistar大鼠，暴露股骨和胫骨骨髓腔，获取骨髓液。密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。以1×105/ml的密度接种于含10﹪胎牛血清的L-DMEM培养液中。置于37℃、5﹪CO2、饱和湿度的CO2孵箱中培养，接种后第3d首次换液去除悬浮细胞，以后每3d换液一次，待贴壁细胞生长融合后，胰酶消化传代。将3～5代的MSCs接种于培养皿中，待细胞生长达80﹪～90﹪融合时开始进行诱导分化。实验分为对照组、bFGF预诱导组和未预诱导组。对照组：不加任何诱导剂。bFGF预诱导组：在bFGF预诱导24h后，再依据加入的神经营养因子不同分为4个亚组，(1)：GM1组；(2)：G组；(3)：G+G组；(4)：G+G+中组。未预诱导组：不经过bFGF预诱导，直接进行诱导分化，4个亚组划分同上。整个诱导过程中，于倒置显微镜下密切观察细胞形态变化，并在诱导第3d、7d时进行NSE、TH、GFAP免疫细胞化学检测。分别计数NSE、TH和GFAP阳性细胞数，计算阳性细胞百分比。 结果：(1)MSCs在体外培养条件下呈增殖性生长，传代后的MSCs迅速贴壁，5～6d可扩增1倍。(2)bFGF预诱导组细胞数量明显增加。大部分细胞形态变成长梭形，排列规则；部分细胞具有神经元形态学特征：折光性增强，逐渐变成卵圆形或圆形，不带突起或向两极伸出突起。(3)各实验组于诱导3d、7d后出现不同数量的NSE、TH阳性神经元样细胞，GFAP阴性。对照组仅见少量NSE阳性细胞。bFGF预诱导组中各亚组可见数量较多的NSE阳性细胞。各亚组与对照组相比NSE阳性细胞率明显增加，差异非常显著(P＜0.01)。不同干预因素的亚组间比较发现，G+G+中组NSE阳性细胞率最高，依次为G+G组、G组、GM1组，组间比较差异显著(P＜0.05)。各亚组7dNSE阳性细胞率与3d相比明显增高，差异非常显著(P＜0.01)。(4)对照组、GM1组和GDNF组均未见TH阳性细胞，G+G组可见少量TH阳性细胞，G+G+中组可见数量较多的TH阳性细胞，而且诱导时间愈长，TH阳性细胞率愈高。 结论：(1)采用改良贴壁培养法成功地进行了大鼠MSCs的体外培养、扩增、传代。(2)bFGF可明显促进大鼠MSCs向神经元分化，部分细胞表现神经元样形态。(3)GDNF可体外诱导MSCs向神经元样细胞分化，表达神经元细胞标志物-NSE。(4)GM1不能单独诱导MSCs分化为神经元样细胞，但与GDNF、bFGF联合，均可明显促进MSCs向神经元分化。(5)GDNF、GM1和中脑条件培养基可联合诱导MSCs向DA能神经元分化，表达DA能神经元标志物-TH。
- 作者：
- 陈欢意
- 学位授予单位：
- 大连医科大学
- 专业名称：
- 神经病学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2006年
- 导师姓名：
- 朱平
- 中图分类号：
- R742.5；R741.05
- 关键词：
- 骨髓基质干细胞；多巴胺能神经元；神经营养因子；单唾液酸四己糖神经节苷脂；帕金森病；体外诱导
- marrow stromal cells；induction；differentiation；dopaminergic neuron；neurotrophic factor；monosialoganglioside