幽门螺杆菌培养方法及其尿素酶纯化的研究
目的: 探讨大量培养H.pylori的方法，提取纯化尿素酶。 方法: 固体培养复苏和传代时分别观察不同添加剂(10％SB、10％SBS和0.1％β-CD)、暴露时间(1h和3h)和抽气负压(-0.075Mpa、-0.070Mpa和-0.065Mpa)对H.pylori培养的影响；液体培养时观察四种添加剂(5％CBS、10％CBS、10％SBS和0.1％β-CD)对H.pylori培养的影响。比较各培养方法的效费关系。用旋涡振荡和冻融法粗提尿素酶，再用阴离子交换、疏水相互作用和阳离子交换三步层析法纯化，测定酶活性，计算总蛋白回收率。用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定。 结果: 固体培养复苏4天，10％SB、10％SBS和0.1％β-CD组每板分别可获H.pylori0.0618g、0.0576g和0.0335g；传代培养3天，分别可获0.0802g、0.0922g和0.0447g。无论复苏或传代，10％SB和10％SBS组H.pylori产量均无统计学差异(P＞0.05)，但均优于0.1％β-CD组(P＜0.01)；不同暴露时间及抽气负压H.pylori产量均无统计学差异(P＞0.05)。液体培养3天，5％CBS、10％CBS、10％SBS和0.1％β-CD组的OD65o值分别为0.2532、0.3705、0.3173和0.2336，10％CBS与10％SBS组均高于0.1％β-CD组(P＜0.05)，10％CBS组高于5％CBS组(P＜0.01)。10％SBS固体培养组每获1gH.pylori所需费用和相对培养批次数分别为24.23元和1.00批次，10％SB固体培养组与其相近(26.28元和1.14批次)。最后纯化得到的尿素酶活性为19.7urea/mg/min，总蛋白回收率为2.58％，SDS-PAGE显示出66kDa和30kDa的蛋白条带，Westernblotting显示其可与兔抗H.pylori全菌血清反应。 结论: 添加10％SB和10％SBS的固体培养可获得较高的H.pylori产量；使用三步层析法可大量快速地纯化尿素酶。
- 作者：
- 刘建东
- 学位授予单位：
- 昆明医学院
- 专业名称：
- 内科学(消化系病学)
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2005年
- 导师姓名：
- 周曾芬
- 中图分类号：
- R378.21；Q556.4
- 关键词：
- 幽门螺杆菌；尿素酶；消化系病学；细菌培养
- Helicobacter pylori；urease；culture；purification；method