猪肺炎支原体P46基因在大肠杆菌中的克隆、表达与ELISA方法研究
猪肺炎支原体(Mycoplasma Nyopneumoniae,M.hp)P46蛋白是M.hp的表面膜蛋白,具有种特异性.M.hp兔化弱毒株R659株、济南强毒株、强毒Z株、国际标准株232的P46基因被克隆到pGEM-T-Easy载体上,经测序表明,克隆序列全长1152bp,编码383个氨基酸和一个终止子(TAA);该序列中含有3个TGA编码Trp,而不是终止密码子.比较兔化弱毒株与济南强毒株、国际标准株232及NCBI上发布的J株的P46基因序列,发现它们的同源性分别为98.6％、99.2％、99.2％;比较它们编码的氨基酸发现它们的同源性分别为98.7％、99.2％、99.2％.结果表明猪肺炎支原体的P46基因在猪肺炎支原体种内是很保守的,因此建立以P46蛋白为诊断抗原的ELISA具有重要的意义.利用PCR方法将克隆在pGEM-T-easy上的猪肺炎支原体P46基因进行突变,将编码Trp的密码子TGA突变为TGG,确保P46基因能在大肠杆菌中表达.将突变后的P46基因克隆到表达载体pMAL-P2X和pMAL-C2X中,测序验证重组表达载体的读码框正确.将重组的表达载体pMAL-P2X-P46和pMAL-C2X-P46分别转化表达工程菌TB1、BL21-DE3和BL21-codon plus-RP,得到6株重组表达菌.pMAL-P2X-P46和pMAL-C2X-P46在BL21-codon plus-RP中以包涵体的形式表达,IPTG的最小诱导浓度为0.07mM.然而,pMAL-P2X-P46和pMAL-C2X-P46在TB1和BL21-DE3中为可溶性表达,其中,pMAL-P2X-P46的表达产物分泌到细胞周质,在TB1和BL21-DE3中表达时,表达的融合蛋白均可达周质分泌物的50％左右.pMAL-C2X-P46的表达产物释放到胞浆,IPTG的最小诱导浓度为0.4mM,在TB1和BL21-DE3中表达时,表达的融合蛋白约占细胞裂解上清30％左右.在Western-Blotting实验中,用兔抗猪肺炎支原体高免血清和兔抗MBP高免血清证实了诱导表达产物为MBP和P46蛋白组成的融合蛋白.M.hp的P46基因在大肠杆菌中可溶性的表达不仅对于建立M.hp的ELISA检测方法打下了基础,对于猪肺炎支原体多肽疫苗研究和支原体的功能基因组学具有重要意义.利用强阴离子交换柱Q XL在pH 7.0,25mM的Tris-C1缓冲液体系下能初步的纯化融合蛋白MBP-P46,通过分子筛SephacryI S-100能进一步纯化融合蛋白,纯化后的融合蛋白经Xa因子酶切后,得到P46蛋白.用强阳离子交换柱SP XL,在pH5.0,25mM的柠檬酸钠的缓冲液体系下可纯化P46蛋白.纯化的MBP-P46和P46经过Western-Blot实验证实后用于ELISA实验.比较以MBP-P46蛋白和P46蛋白做为抗原建立的ELISA方法,发现P46蛋白作为检测抗原更加敏感,每孔包被P46抗原lug或0.5ug,检测20倍稀释的参考血清,P/N值最高可达7.6.该研究为我们进一步建立以P46蛋白为诊断抗原的ELISA方法打下了坚实的基础.
- 作者：
- 覃青松
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2004年
- 导师姓名：
- 宁宜宝
- 中图分类号：
- S858.28；S852.62
- 关键词：
- 猪肺炎支原体(M.HP)；P46基因；突变；表达；蛋白纯化；ELISA
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