猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E2基因在原核与真核表达系统中的表达
在猪瘟病毒(CSFV)编码的蛋白中,E2是最易发生变异的一种蛋白,但又是猪瘟病毒的主要保护性抗原蛋白,能诱导机体产生中和性抗体.鉴于E2蛋白在CSFV感染、复制及诱导免疫等方面的重要作用,该研究将中国兔化弱毒株(HCLV)的E2基因同时用原核和真核系统进行了表达,分析了E2基因TMR对表达的影响,并用大肠杆菌表达的重组蛋白初步建立了间接ELISA方法.同时对19个毒株的24条E2基因序列进行对比,分析了CSFV的遗传衍化关系,为CSFV的流行病学研究提供参考依据.首先,该研究采用RT-PCR和nested PCR扩增了长度为1017bp(无跨膜区,TMR)、1065bp(含1个TMR)和1125bp(含3个TMR)的HCLV E2基因,随后将它们分别克隆至pGEX-4T-1和pMAL-p2X中,构建了重组质粒pGEXTE2-339(无TMR)、pGEXTE2-355(1个TMR)、pGEXTE2-375(3个TMR)和pMALTE2-339(无TMR),并用BL21-CodonPlus(DE3)-RP(该文简写为CP)宿主菌高效表达了pGEXTE2-339、pGEXTE2-355和pMALTE2-339.目的蛋白表达量分别约为15％、9％和28％.而pGEXTE2-375尚未得到表达产物,说明疏水性的TMR对HCLV E2基因在大肠杆菌中的表达及表达量有一定的影响.对表达产物进行鉴定分析后得知,目的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中.对包涵体GSTTE2-339(由pGEXTE2-339表达)和GSTTE2-355(由pGEXTE2-355表达)用1％Triton X-100和2M尿素进行洗涤、变性复性后用亲和层析的方法进行纯化,再用变性蛋白和复性蛋白为诊断抗原来监测CSFV血清抗体,结果表明变性蛋白和复性蛋白对所测样品均比较敏感,初步建立了用GSTTE2融合蛋白作为诊断抗原来监测CSFV抗体的ELISA诊断方法.其次,为了获得可溶性重组E2糖蛋白,并便于观察E2基因的表达情况,将增强型荧光蛋白(EGFP)基因与HCLV E2基因(无TMR)的融合基因GFPTE2克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A中,与杆状病毒线性DNA(Bac-N-Blue)共转染sf9细胞,经噬斑筛选后获得重组杆状病毒rBACTE2-339,将其感染sf9细胞后经传代扩增制备P1、P2高效价毒种,并用P2感染sf9细胞观察表达情况,感染72hr后在荧光显微镜下可观察到遍布视野的亮绿色荧光.说明重组杆状病毒中的融合基因GFPTE2在sf9细胞中获得了初步表达.同时为了研究E2基因在哺乳动物细胞表达系中的表达情况,将GFPTE2融合基因置于带有二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的pCI表达载体CMV启动子下,构建了真核表达质粒pCIGFPTE2-339,转染CHO(dhfr-)细胞后用0.25uM的氨甲喋呤(MTX)加压筛选,10天后观察到了分布于胞浆的索状暗绿色荧光.说明GFPTE2融合基因在CHO(dhfr-)中获得了初步表达,用pCI载体在CHO细胞中表达E2基因尚属首次.最后,借助生物信息学方法对不同毒株E2基因的同源性进行了对比,并绘制了进化树,说明中国的HCLV和SM株与国外Brescia株为基因Ⅰ群,而39、LN、07株与国外的Alfort株同属基因Ⅱ群,P97单独为一群.同时,对E2基因的亲水性和抗原指数进行了计算和比较,发现不同亚群的代表毒株之间存在细微差异,但对E2蛋白中的Cys分析后,表明E2蛋白中15个Cys高度保守,推测E2蛋白的构型是稳定的,与HCLV疫苗免疫后对不同毒力、不同地理分布和不同分离时间野毒株100％的抵抗力结果是相吻合的.该研究为CSFV E2蛋白结构与功能及基因工程新型疫苗的进一步研究奠定了基础.
- 作者：
- 范学政
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2003年
- 导师姓名：
- 王在时；王琴
- 中图分类号：
- S852.651
- 关键词：
- 猪瘟病毒；E2基因；原核表达；真核表达；序列分析
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