应用ISSR技术探讨冬青属苦丁茶种质资源的遗传多样性和分类地位
“苦丁茶”是我国民间用作传统代茶饮料或中草药的一大类植物的统称，具有较高的饮用和药用价值，其中以冬青科冬青属的“苦丁茶”最具影响。本研究利用ISSR分子标记技术系统地分析了以苦丁茶冬青(IlexkudingchaC.J.Tseng)为代表的冬青属苦丁茶的遗传多样性，并探讨了苦丁茶冬青与其近缘种五棱苦丁茶(I.pentagonaS.K.ChenY。X.Fenget.C.F.Liang)的亲缘关系以及表型性状介于二者之间的“中间类型”材料的分类地位。研究结果如下： 1.通过对冬青属苦丁茶ISSR反应各影响因子进行了系统地优化，建立了本实验ISSR分析最佳反应体系：10xbuffer2.5μl，DNA模板20ng，2.5mmol/LMgCl2，200μmol/LdNTPs，Taq酶1.0U，引物0.2μmol/L，用无菌超纯水补足至25μl；PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后按94℃变性1min，48～56℃退火45s，72℃延伸2min，进行35个循环，72℃后延伸5min，4℃冷却取出。本研究均在上述最佳反应条件下进行，得到了稳定性好、重复性高的扩增结果。 2.利用ISSR技术对冬青属“苦丁茶”6个物种即苦丁茶冬青(I.kudingchaC.J.Tseng)、大叶冬青(I.latifoliaThunb.)、五棱苦丁茶(I.pentagonaS.K.ChenY.X.Fenget.C.F.Liang)、枸骨(I.cornutaLindl.)、华中枸骨(I.centrochinesisS.Y.Hu)、霍山冬青(I.huoshanensisY.H.He)以及表型性状介于五棱苦丁茶与苦丁茶冬青之间的“中间类型”材料共51份种质材料进行了分析。从80条ISSR引物中筛选出18条有效引物，共检测到351个位点，其中多态位点318个，多态位点百分率(PPB)为90.6％。UPGMA法聚类分析结果表明：ISSR技术可以将供试的冬青属6个物种和一类“中间类型”材料明显区分开来，各物种之间遗传差异较大，遗传距离在0.0771～0.7631之间，平均遗传距离为0.4152。苦丁茶冬青和五棱苦丁茶分别单独聚类，从分子水平支持五棱苦丁茶作为新种的观点，与形态学的分类结果一致。 3.利用ISSR技术对57份苦丁茶冬青种质材料、13份五棱苦丁茶种质材料以及介于二者之间的6份中间类型种质材料进行了分析。从80条ISSR引物中筛选出20条有效引物，共检测到346个位点，其中多态性位点304个，多态位点百分率(PPB)为87.8％。苦丁茶冬青种质材料的遗传多样性分析表明：在物种水平上，多态位点百分率(PPB)=85.6％，有效等位基因数(Ne)=1.3657，Nei’s基因多样性指数(H)为0.3252，Shannon信息多样性指数(Ⅰ)为I=0.3531:在居群水平上，PPB=77.9％，Ne=1.1929，H=0.1260，I=0.1795。基于Nei’s遗传多样性分析得出的居群间遗传多样性分化系数(Gst)=0.4184，基因流(Nm)为0.6950＜1。结果表明：苦丁茶冬青居群间的基因交流有限，居群的变异主要发生在居群内(58.16％)，居群间变异小于居群内。聚类分析结果表明：苦丁茶冬青不同地域起源的种质材料在聚类图中明显分为海南、广东、广西三大居群，供试材料的遗传距离在0.2689～0.5378之间。在聚类图中，广东居群先与广西居群聚在一起，然后才与海南居群聚在一起，也表明了不同地理起源与材料间的亲缘关系远近是一致的。同一起源地域内的种质材料遗传距离较小，不同起源地域的种质材料遗传距离较大，特别是起源于海南岛的苦丁茶冬青种质材料与起源于大陆各区域的苦丁茶冬青种质材料遗传差异较大，故作者认为可将其划分为苦丁茶冬青的一个生态型。 4.中间类型材料在聚类图中单独归聚为与五棱苦丁茶种质材料平行的一分支，二者再聚合，形成与苦丁茶冬青平行的一支。基于形态特征和分子标记研究均表明这类中间类型材料在分类学上无论是归类于苦丁茶冬青或归类于五棱苦丁茶均是不合适的。野外考察发现这些材料的原产地同时生长着苦丁茶冬青和五棱苦丁茶，且这两个种都为异花授粉植物，花期又大致相同。因此，有理由推测这类“中间类型”材料很可能是苦丁茶冬青和五棱苦丁茶的天然种间杂交后代。作者认为，ISSR分析的结果支持将中间类型划分为五棱苦丁茶的一个变种，而典型的五棱苦丁茶作为原变种。
- 作者：
- 王小精
- 学位授予单位：
- 海南大学
- 专业名称：
- 作物遗传育种
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2008年
- 导师姓名：
- 刘国民
- 中图分类号：
- S571.1
- 关键词：
- 苦丁茶；种质资源；遗传多样性；苦丁茶冬青
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