牙鲆碱性磷酸酶全基因的克隆、序列分析及5'调控区功能分析

碱性磷酸酶(ALP)是一种单脂磷酸水解酶，它本身是一种膜结合金属糖蛋白。ALP由一个多基因家族编码，目前人和小鼠的ALP基因均已被克隆。根据基因限位，人和小鼠都有一种组织非特异性ALP(Tissue-nonspecific alkaline phosphatase，TSNALP)，在肝、肾、骨骼、早期胚胎等组织中表达。另外，人和小鼠还分别有3种和2种组织特异性ALP(tissue-specific alkaline phosphatase，TSALP)，包括人的肠ALP、胎盘ALP和生殖细胞ALP；小鼠的肠ALP和胚胎ALP。 目前在哺乳动物中关于ALP基因的克隆、生理功能及转录调控机制已有很多报道，但水生动物ALP基因的克隆、表达和调控的研究鲜有报道。近几年本实验室围绕着ALP在牙鲆变态发育中的作用，开展了一系列工作，研究表明ALP活性的变化明显影响变态时期牙鲆仔鱼的骨骼细胞的形态及消化功能。本实验室通过RACE的方法克隆了牙鲆ALP基因cDNA序列，而且通过荧光定量PCR检测发现，在体内水平甲状腺激素可以上调ALP的表达。为了确定牙鲆ALP基因的类型、分析基因结构特征，本研究首次在鱼类中分离出ALP全基因序列。牙鲆碱性磷酸酶基因全长10kb，含有11个外显子、10个内含子。11个外显子的长度分别是69bp、117bp、117bp、174bp、174bp、141bp、69bp、135bp、192bp、84bp、410bp。10个内含子长度分别是1587bp、170bp、356bp、1857bp、91bp、331bp、791bp、1188bp、1209bp、791bp，A／T含量分别是62％、51％、66％、60.04％、51.6％、59.5％、61.6％、59.3％、55.1％、56％，符合内含子A／T含量高的特点。外显子和内含子的连接符合GT-AG的剪切原则(除了外显子10)。起始密码子ATG位于第一个外显子，ALP活性位点序列位于第4个外显子。在线软件预测第一个内含子中两个位点可能具有启动子活性，同时存在Ccaat／Enhancer Box、RXR、CAAT、CREB、Octamer、GATA、ERE、SREBPs、APl、锌指蛋白等转录因子结合位点。此外，在第三个、第九个内含子中存在(CA)23、(TG)55、(TG)12重复的微卫星序列，目前，这些微卫星序列在Genbank中还没有登录，可能是新的微卫星标记。根据牙鲆ALP全基因的结构特征以及mRNA的组织分布特点，认为克隆的牙鲆ALP属于组织非特异性ALP。 利用生物信息学对克隆得到的牙鲆ALP基因5''调控区进行分析，牙鲆ALP基因的转录起始位点(transcription start site，TSS)位于翻译起始密码子(ATG)上游65bp处，牙鲆ALP基因5''调控区没有典型的TATA、CAAT、GC盒，推测转录起始位点上游-42～-35处TATTAAAA可能是TATA盒，在线软件分析表明5''调控区内可能含有GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit1、RARE／TRE、AP4等转录因子结合位点。同时软件预测在牙鲆ALP基因5''调控区-105～-81处TTTTCAGTCACTGGTCATAAATTTG与共有序列AGGTCA很相似，所以推测CAGTCACTGGTCA可能是一个视黄酸／甲状腺激素应答元件，且由两个同向重复(Direct Repeat，DR)的半位点组成，两个半位点间隔为1，记作DR1。系统发育树显示牙鲆ALP基因5’调控区序列与斑马鱼的组织非特异性ALP启动子具有同源性且更接近于哺乳动物的组织非特异性ALP启动子，启动子区域的分子进化树与cDNA进化树以及物种进化树基本一致。 为了进一步证实牙鲆ALP基因5''调控区和第一个内含子的启动子活性，采用DNA重组的方法，将克隆得到的ALP基因5''调控区、第一个内含子序列插入到启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1、萤光素酶报告基因载体PGL3-Basic中，构建了重组表达载体。重组的EGFP载体通过脂质体的方法转染COS-7细胞进行瞬时表达，在倒置荧光显微镜下可以检测到绿色荧光信号，且荧光信号随着时间的延长而增强。萤光素酶活性检测结果与绿色荧光蛋白表达结果一致都表明本实验克隆的牙鲆碱性磷酸酶基因5''调控区及第一个内含子序列具有一定的启动子活性，活性分别是0.011808±2.86E-4、0.011742±8.25E-5，小于阳性对照人IAP启动子(0.014245±2.239E-3)。该研究结果为今后进一步研究碱性磷酸酶基因表达调控的分子机制奠定了基础。