猪繁殖与呼吸综合征病毒经典毒株和变异毒株NASBA-ELISA鉴别诊断方法的建立及应用
The Establishment and Application of NASBA-ELISA for Differential Diagnosis of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Classical and Variation Subtypes
本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸练合征病毒(PRRSV)的基因序列,建立了3种核酸序列依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification,NASBA)-ELISA:NASBA-ELISA(A)、NASBA-ELISA(C)和NASBA-ELISA(V)方法,分别用于检测美洲型PRRSV,并鉴别PRRSV经典毒株和变异毒株.用建立的NABSA-ELISA方法和商品化RT-PCR试剂盒,同时检测人工感染PRRSV不同毒株的猪,以比较NASBA-ELISA和RT-PCR方法检测PRRSV的敏感性.针对PRRSVORF7基因和ORF1a中Nsp2基因的保守序列以及Nsp2基因缺失信息,设计并合成3组引物和探针.通过优化反应条件,建立了扩增美洲型PRRSV,PRRSV经典毒株和PRRSV变异毒株RNA的NASBA方法:NASBA-A,NASBA-C和NASBA-V.NASBA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见有预期大小的目的条带.NASBA扩增产物经northern印迹进一步验证了NASBA扩增的特异性,同时也表明检测探针具有特异性.然后通过优化ELISA反应条件,建立了检测NASBA扩增产物的ELISA方法.对建立的NASBA-ELISA(A)、NASBA-ELISA(C)和NASBA-ELISA(V)方法进行验证,表明其具有良好的敏感性、特异性和重复性.用PRRSV不同毒株人工感染不同日龄的猪,于感染后定期采集血液、鼻拭子样品,并在猪死亡或被处死后解剖、采集组织脏器,用所建立的三种NASBA-ELISA方法和商品化RT-PCR试剂盒检测这些样品.结果显示,NASBA-ELISA和RT-PCR结果的符合率为83.91%(219/261),且NASBA-ELISA(C)和NASBA-ELISA(V)能准确地区分PRRSV经典毒株和变异毒株;NASBA-ELISA检测血液样品、鼻拭子样品和组织样品的阳性检出率均高于RT-PCR,表明NASBA-ELISA的检测敏感性高于RT-PCR;NASBA-ELISA检测血液样品比检测鼻拭子样品敏感,表明血液比鼻拭子更适合作为NASBA-ELISA检测PRRSV的样品.
- 作者：
- 梁海霞
- 学位授予单位：
- 中国兽医药品监察所
- 专业名称：
- 预防兽医学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2009年
- 导师姓名：
- 夏业才；郎洪武
- 中图分类号：
- S852.65
- 关键词：
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒；美洲型；经典毒株和变异毒株；酸序列依赖性扩增；ELISA；鉴别诊断
- Porcine reproductive and respiratory syndrome virus；American genotype；classical strains and variant strains；Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA)；ELISA；differential diagnosis